白菜miR158的表達及其在花粉發(fā)育中的功能鑒定.pdf

1、植物microRNA（miRNA）是一種植物內源產生的非編碼RNA，通過對其靶基因表達進行轉錄后負調控，從而參與植物的生長發(fā)育過程?；ǚ郯l(fā)育是種子植物有性生殖的一個重要環(huán)節(jié)。有報道多個miRNA可能參與花粉發(fā)育過程。在前期的研究中，本實驗室以一對隱性基因控制的白菜核不育兩用系‘Bcajh97-01A/B’為材料，對花粉發(fā)育相關miRNA進行了高通量測序，鑒定到miR158在不育株和可育株中差異表達明顯，并發(fā)現過表達白菜mi158可引起花

2、粉發(fā)育異常。
　　在本文中，我們繼續(xù)對白菜mi158在花粉發(fā)育過程中的功能進行研究。首先克隆了白菜miR158的兩個前體基因及其靶基因Bra027656，隨后利用qRT-PCR和啟動子-GUS報告系統(tǒng)分析了白菜miR158兩個前體基因的時空表達模式，最后通過觀察過表達和抑制表達白菜miR158引起的轉基因植株表型差異，對白菜miR158及其靶基因的功能和可能的作用模式進行了初步的研究。獲得的主要結果和結論如下:
　　(1)以

3、預測得出的白菜miR158的兩個前體發(fā)卡序列為依據設計引物，克隆獲得白菜miR158的兩個前體基因。這兩個前體基因分別位于5號和8號染色體，其轉錄產物能夠形成穩(wěn)定的二級結構，同時在miRNA和miRNA*區(qū)域高度保守，這符合miRNA的進化特征，也暗示了miR158功能的保守性。共線性分析結果表明這兩個前體基因所在的基因組區(qū)域能夠對應到擬南芥miR158a所在的區(qū)域，系原始的Ath-miR158a伴隨蕓薹屬基因組三倍化后保留的產物，因此

4、我們將其分別命名為Bra-miR158a1和Bra-miR158a2。
　　(2)利用RACE技術分析明確了白菜miR158的靶基因Bra027656的5'和3'cDNA序列，并據此設計引物克隆獲得該基因。其DNA序列全長2175 bp，由兩個外顯子和一個內含子組成，ORF全長2046bp，編碼一個由682個氨基酸組成的PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白。通過BLAST搜索，發(fā)現Bra027656氨基酸

5、序列與蘿卜的細胞質雄性不育系育性恢復相關PPR-B蛋白氨基酸序列高度相似。這暗示了Bra027656可能與PPR-B具有相同的作用模式。
　　(3) qRT-PCR分析結果表明pre-Bra-miR158a1和pre-Bra-miR158a2的表達存在時空差異。雖然兩者均在花序中有較高的表達量，但前者的相對表達量高于后者，尤其是在第三級花蕾時期（單核花粉粒時期），啟動子-GUS報告系統(tǒng)分析Bra-miR158a1和Bra-miR1

6、58a2的啟動子活性也獲得了相似的結果。據此，我們認為白菜miR158可能在花粉發(fā)育的單核花粉粒至雙核花粉粒時期發(fā)揮作用，而且pre-Bra-miR158a1對miR158的合成起主效作用。通過序列比對，發(fā)現pre-Bra-miR158a1和pre-Bra-miR158a2啟動子序列存在較大的差異，推測兩者差異的時空表達模式可能是由啟動子序列的差異引起。
　　(4)構建抑制表達Bra-miR158載體，連同前期已構建好的過表達Br

7、a-miR158載體轉化‘油青四九’菜心。通過對獲得的轉基因植株進行細胞學和形態(tài)學觀察，發(fā)現過表達Bra-miR158轉基因植株藥室中約25％的花粉喪失活力，無活力花粉的異常發(fā)育始于單核小孢子時期，花粉內含物降解，花粉皺縮或空泡化。結合Bra-miR158的時空表達模式，這說明白菜miR158對花粉的形成具有重要作用。然而，抑制表達Bra-miR158轉基因植株生長發(fā)育并未出現異常，這說明存在白菜miR158靶因的下游基因對靶基因的缺失