白菜組蛋白賴氨酸甲基化相關(guān)SDG家族的演化與在花粉發(fā)育中的作用分析.pdf

1、花粉發(fā)育是植物有性生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，涉及有絲分裂、減數(shù)分裂等截然不同的細(xì)胞學(xué)過(guò)程以及絨氈層降解、花粉壁形成等獨(dú)一無(wú)二的生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)也與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的雄性不育、作物產(chǎn)量、種子品質(zhì)等問(wèn)題密切相關(guān)，對(duì)該過(guò)程的研究兼具理論與實(shí)踐意義。組蛋白賴氨酸甲基化共價(jià)修飾通過(guò)對(duì)花粉發(fā)育相關(guān)基因的選擇性轉(zhuǎn)錄參與這一過(guò)程。在植物中，SET domain group(SDG)家族是唯一具有組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白家族，其在多個(gè)物種中的成員組成業(yè)已明確，對(duì)

2、亞家族的分類方式也已達(dá)成共識(shí)。但是目前對(duì)SDG家族的演化過(guò)程缺乏系統(tǒng)性研究，對(duì)四個(gè)主要亞家族之間的相對(duì)演化關(guān)系也并不明確。此外，數(shù)個(gè)SDG基因已被證實(shí)在擬南芥中表達(dá)的異常會(huì)引起花粉敗育，而對(duì)擬南芥不同發(fā)育時(shí)期花粉芯片表達(dá)數(shù)據(jù)的梳理表明應(yīng)有更多的SDG基因參與了這一過(guò)程。本研究基于已公布的基因組數(shù)據(jù)，對(duì)白菜SDG家族的成員進(jìn)行篩選查找、序列分析，并通過(guò)與擬南芥直系同源基因的比較，探討了白菜SDG家族的演化過(guò)程以及四個(gè)主要亞家族基因的演化模

3、式及起源。隨后，對(duì)H3K4me3和H3K27me3兩種與基因表達(dá)密切相關(guān)的共價(jià)修飾在白菜花粉發(fā)育中的變化進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，并從白菜花蕾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到了一系列可能與花粉發(fā)育相關(guān)的候選SDG基因。最后，分析了一個(gè)在白菜雄性不育株系花序中特異高表達(dá)的SDG基因(ASHR1)的表達(dá)模式，并分別以白菜和擬南芥為材料對(duì)該基因的功能進(jìn)行了鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)對(duì)白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，篩選得到白菜SDG基因67個(gè)，并根據(jù)它

4、們與擬南芥基因的共線性關(guān)系，找到2個(gè)額外的擬南芥SDG基因。白菜SDG基因分布在10條染色體上，與擬南芥直系同源基因具有良好的共線性關(guān)系;它們分屬于7個(gè)亞家族，各亞家族之間在基因長(zhǎng)度、基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域上具有明顯差異;相比于其他物種，白菜SDG基因數(shù)目多，占基因組比例大;大量旁系同源基因?qū)υ诒磉_(dá)模式和亞細(xì)胞定位上具有顯著差異。
　　(2)通過(guò)與擬南芥直系同源基因的比較，發(fā)現(xiàn)白菜SDG家族中E(z)、Ash、Trx和Suv四

5、個(gè)主要亞家族的成員與擬南芥直系同源基因具有較大差異。其中逾半數(shù)基因的基因結(jié)構(gòu)與擬南芥直系同源基因存在差異，這些差異涉及內(nèi)含子的增加、丟失，外顯子的增加、丟失以及內(nèi)含子相位的移動(dòng)。結(jié)合其他物種直系同源基因的序列分析，表明這些差異基本產(chǎn)生自白菜。蛋白結(jié)構(gòu)域架構(gòu)分析同樣表明大量白菜SDG蛋白有別于擬南芥直系同源蛋白，且部分結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域的架構(gòu)方式在所研究的其他物種中都不存在，而僅存在于白菜。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)和基因槍介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)

6、胞瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)白菜和擬南芥中4對(duì)直系同源SDG蛋白具有不同的亞細(xì)胞定位。利用PhylogeneticAnalysis by Maximum Likelihood(PAML)軟件進(jìn)行的分子演化速率分析表明近1/3的白菜SDG基因具有較快的分子演化速率。
　　(3)通過(guò)對(duì)SET結(jié)構(gòu)域內(nèi)含子相位的分析，明確了SDG家族四個(gè)主要亞家族的演化模式。E(z)亞家族起源于1個(gè)祖先基因，Ash亞家族起源于3個(gè)祖先基因，Trx亞家族起源于2個(gè)祖

7、先基因，Suv亞家族起源于3個(gè)祖先基因。對(duì)四個(gè)主要亞家族基因在基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域架構(gòu)、亞細(xì)胞定位和分子演化速率上差別的綜合分析表明，各亞家族之間在演化速率上具有明顯差異。其中Trx亞家族演化速率最快，SUVR亞族次之，E(z)亞家族再次之，而SUVH亞族和Ash亞家族演化速率最慢。
　　(4)利用免疫熒光分析確定了H3K4me3和H3K27me3兩種共價(jià)修飾在白菜花粉發(fā)育中的變化模式。H3K4me3存在于花粉母細(xì)胞、單核小孢子的細(xì)胞

8、核以及雙核花粉的營(yíng)養(yǎng)核和三核花粉的營(yíng)養(yǎng)核和精細(xì)胞。H3K27me3除同樣存在于上述時(shí)期花粉的細(xì)胞核外，還存在于雙核花粉的精核中。兩種共價(jià)修飾都不存在于四分體時(shí)期的花粉。
　　(5)對(duì)白菜從花粉母細(xì)胞時(shí)期到成熟花粉期5個(gè)不同發(fā)育級(jí)別花蕾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，44個(gè)白菜SDG基因在花蕾各發(fā)育階段表達(dá)，除一個(gè)基因外，其余基因根據(jù)其表達(dá)模式可以分為5個(gè)類群，分別對(duì)應(yīng)于花粉發(fā)育的5個(gè)時(shí)期。其中70％的基因在花蕾發(fā)育的不同階段差異表達(dá)，4

9、1％的基因在可育株系和不育株系各級(jí)花蕾中差異表達(dá)。通過(guò)與擬南芥芯片數(shù)據(jù)的綜合比較，篩選得到7個(gè)極有可能作用于花粉發(fā)育的候選SDG基因，包括2個(gè)已證實(shí)作用于該過(guò)程的基因。
　　(6)利用定量PCR技術(shù)研究表明，實(shí)驗(yàn)室早期利用擬南芥芯片篩選得到的在不育株系中高表達(dá)的SDG基因ASHR1在除代表四分體時(shí)期花蕾以外的花蕾中表達(dá)量均高于可育株系。原位雜交分析表明該基因在單核小孢子和雙核花粉中表達(dá)。
　　(7)通過(guò)全長(zhǎng)擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)白菜ASH

10、R1基因座上至少可以生成5種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，其中原始轉(zhuǎn)錄本（BrASHR1.1）表達(dá)水平顯著高于其他轉(zhuǎn)錄本。擬南芥ASHR1基因座上存在2種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，原始轉(zhuǎn)錄本(AtASHR1.1)的表達(dá)水平與可變剪接轉(zhuǎn)錄本(AtASHR1.2)的表達(dá)水平相當(dāng)。此外，通過(guò)在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtASHR1.2，發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的AtASHR1.2會(huì)被剪接形成AtASHR1.1。
　　(8)ASHR1在白菜和擬南芥中的過(guò)表達(dá)沒(méi)有對(duì)花粉和種子等的發(fā)育產(chǎn)