組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1及其下游因子對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見的實(shí)體腫瘤之一，其惡性程度高、異質(zhì)性高、易對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)。但自行消退與體外誘導(dǎo)分化成熟的特點(diǎn)，使其成為研究腫瘤分化的較好的模型，闡釋其增殖和分化的機(jī)制，能夠?yàn)樵撃[瘤的治療提供新策略。研究者發(fā)現(xiàn)異常的組蛋白甲基化修飾往往引起基因表達(dá)活性的改變，從而成為腫瘤發(fā)生的主要誘因之一。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1，主要催化H3K9me3甲基化，在多種類型的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，膠

2、質(zhì)瘤和前列腺癌等，下調(diào)其表達(dá)會(huì)抑制癌細(xì)胞的增殖分化以及侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　本研究探究組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶 SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及分化的影響及其機(jī)制，揭示了SETDB1及其下游效應(yīng)因子在母瘤增殖和分化過程中的重要作用，以期能為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新思路。以下是本論文主要發(fā)現(xiàn)：
　　1.SETDB1參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控
　　我們采用Western blot和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到SE

3、TDB1蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中有普遍表達(dá)，接著利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干涉技術(shù)在細(xì)胞系BE(2)-C和SHEP1細(xì)胞系中對(duì)SETDB1的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示SETDB1si細(xì)胞的生長受到明顯抑制。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SETDB1si細(xì)胞的克隆形成能力明顯下降。同時(shí)我們通過建立荷瘤鼠模型，發(fā)現(xiàn)SETDB1si細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力降低。最后，我們通過Microarray分析，并采用熒光定量PCR技術(shù)，Western blot

4、和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BE(2)-C和SHEP1細(xì)胞系的分化情況，發(fā)現(xiàn)SETDB1si細(xì)胞向著膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生分化。
　　2.SETDB1調(diào)控嘌呤代謝途徑的關(guān)鍵酶基因PRPS1，而PRPS1也對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和成瘤有影響
　　我們對(duì)SETDB1si細(xì)胞進(jìn)行了Microarray分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)SETDB1影響了細(xì)胞的嘌呤代謝相關(guān)途徑。PRPS1是嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵限速酶，我們利用Western blot和熒光定量PCR技

5、術(shù)檢測(cè)到在SETDB1si的細(xì)胞中，PRPS1的表達(dá)也受到了抑制。接著我們對(duì)SETDB1以及PRPS1的啟動(dòng)子進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，SETDB1以及H3K9me3均與PRPS1下游啟動(dòng)子676-859bp區(qū)域有顯著結(jié)合，表明SETDB1能夠調(diào)控PRPS1基因的轉(zhuǎn)錄，我們推測(cè)SETDB1可能通過調(diào)控PRPS1的表達(dá)來進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖。我們通過分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)PRPS1高表達(dá)會(huì)顯著降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的

6、生存率，且PRPS1的表達(dá)水平與腫瘤患者的患病年齡、死亡原因、復(fù)發(fā)情況以及N-MYC的表達(dá)量等相關(guān)。因此我們利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干涉技術(shù)在細(xì)胞系BE(2)-C和SHEP1細(xì)胞系中對(duì)PRPS1進(jìn)行下調(diào)。首先我們利用Western blot和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到PRPS1蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中有普遍表達(dá)，然后利用細(xì)胞增殖標(biāo)記BrdU進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRPS1si后細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)BrdU陽性率明顯降低，表明細(xì)胞的增

7、殖受到抑制。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示PRPS1si后細(xì)胞的生長受到明顯抑制。流式細(xì)胞儀分析PRPS1si的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于G1期。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRPS1si細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低，細(xì)胞的自我更新和增殖活性受到明顯抑制。最后我們通過建立荷瘤鼠模型，發(fā)現(xiàn)PRPS1si細(xì)胞的成瘤能力降低。上述結(jié)果與前述SETDB1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，SETDB1通過調(diào)控PRPS1表達(dá)進(jìn)而影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和成瘤。
　　3.SETD

8、B1調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤原癌基因N-MYC的表達(dá)
　　為了研究SETDB1引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的機(jī)制，我們分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)SETDB1的表達(dá)量在有N-MYC擴(kuò)增的患者中顯著高于沒有N-MYC擴(kuò)增的患者。N-MYC最先在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中被證實(shí)為原癌基因，它通過影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤自我更新和分化能力，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。我們通過Microarray分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SETDB1，包含N-MYC在內(nèi)的與神

9、經(jīng)母細(xì)胞瘤自我更新能力的相關(guān)基因表達(dá)下降，進(jìn)一步通過熒光定量PCR以及Western blot證實(shí)，下調(diào)SETDB1顯著的降低了N-MYC的表達(dá)，說明SETDB1的確影響N-MYC表達(dá)。然后我們?cè)诟缮娴鬝ETDB1的SHEP1細(xì)胞中過表達(dá)N-MYC，通過MTT實(shí)驗(yàn)以及BrdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)可以看出，SHEP1-SETDB1si-N-MYC細(xì)胞的增殖能力得到一定恢復(fù)。最后我們?yōu)榱搜芯?SETDB1與 N-MYC的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)行了ChIP-qPC

10、R實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 SETDB1以及H3K9me3均直接與N-MYC啟動(dòng)子上游區(qū)域-2885~-2723bp片段直接結(jié)合，暗示SETDB1直接調(diào)控原癌基因N-MYC，從而影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖和分化。
　　綜上所述，SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、分化以及自我更新能力都具有重要作用；SETDB1的下調(diào)也會(huì)顯著抑制嘌呤代謝途徑關(guān)鍵酶基因PRPS1的表達(dá)，ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明SETDB1能調(diào)控PRPS1的表達(dá)，因此我們推測(cè)S