緩激肽選擇性開放血腫瘤屏障機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 血腦屏障可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)物質(zhì)在血液循環(huán)和腦組織的交換，保持腦組織內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定，同時(shí)也限制了藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。藥物通過血腫瘤屏障一般有兩種途徑：細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。研究表明小劑量緩激肽可以選擇性開放血腫瘤屏障，而不影響正常腦組織。但BK選擇性開放BTB的機(jī)制還不是很清楚，有研究對(duì)體外BTB模型的跨內(nèi)皮細(xì)胞阻抗進(jìn)行了測(cè)量，發(fā)現(xiàn)BK作用后，BTB的TEER值降低，緊密連接開放；但到目前為止關(guān)于BK是否能夠開放TJ仍有爭(zhēng)

2、議；而且沒有進(jìn)一步闡述BK開放TJ的機(jī)制。此外，很多研究都顯示BK能夠通過增加跨內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡的數(shù)量增加BTB的通透性．經(jīng)典的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)包括clathrin包被途徑、caveolae誘導(dǎo)的內(nèi)化途徑和其他的clathrin/caveolae非依賴機(jī)制。BK究竟通過哪條跨細(xì)胞途徑增加吞飲小泡仍不清楚。 cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。很多研究表明cAMP能夠上調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白的水平，增加內(nèi)皮細(xì)胞的跨細(xì)胞阻

3、抗值，從而加強(qiáng)緊密連接的緊密度。此外，cAMP可通過蛋白激酶A依賴或非依賴途徑調(diào)節(jié)緊密連接。但cAMP/PKA途徑是否參與BK開放緊密連接還不清楚。 本研究為了明確緩激肽與B2受體結(jié)合后是否能夠通過調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白開放緊密連接，cAMP/PKA信號(hào)分子是否參與了緩激肽開放緊密連接的調(diào)節(jié)過程，以及是否caveolae介導(dǎo)緩激肽增加內(nèi)皮細(xì)胞的吞飲小泡。 方法： 1、大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型和體外血腫瘤屏障模型的制備。

4、 2、應(yīng)用伊文氏蘭檢測(cè)緩激肽作用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障滲透性變化，透射電鏡技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的狀態(tài)和內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡數(shù)量的改變。 3、應(yīng)用millipore公司的Millicell-ERS電阻測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量體外血腫瘤屏障的TEER值。 4、應(yīng)用辣根過氧化物酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外血腫瘤屏障的通透性。 5、應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光法檢測(cè)緩激肽作用后腦膠質(zhì)瘤大鼠和體外血腫瘤屏障模型上緊密連接相關(guān)蛋白ZO-

5、1、occludin、claudin-5和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的分布和表達(dá)水平的變化；檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤大鼠caveolin-1和caveolin-2的分布和表達(dá)水平變化。 6、應(yīng)用Western blot法檢測(cè)緩激肽作用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠和體外血腫瘤屏障模型上緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白質(zhì)表達(dá)水平：檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中caveolin-1和caveolin-2的蛋白表達(dá)水平。

6、7、分別應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)緩激肽作用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中cAMP的含量和PKA催化亞單位的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、成功建立了大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型和體外血腫瘤屏障模型。 2、緩激肽作用后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠緊密連接開放，血腫瘤屏障滲透性增加；體外血腫瘤屏障模型的TEER值降低，HRP通透性增加．上述各指標(biāo)在緩激肽作用15min時(shí)變化最明顯，以后逐漸恢復(fù)。 3、C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中微血管上的緊密連接

7、相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和細(xì)胞骨架蛋白F-actin在緩激肽作用后表達(dá)減少，在15 min時(shí)達(dá)最低值，以后逐漸恢復(fù)． 4、緩激肽作用后，體外血腫瘤屏障模型上內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5由沿著細(xì)胞邊緣連續(xù)分布變?yōu)椴贿B續(xù)，上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平降低；細(xì)胞骨架蛋白F-actin在細(xì)胞邊緣的分布減少，應(yīng)力纖維增加。 5、緩激肽作用后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中

8、caveolin-1的蛋白表達(dá)水平增加，在緩激肽作用15 min時(shí)達(dá)峰值，以后逐漸恢復(fù)；而caveolin-2在緩激肽作用的各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。 6、緩激肽作用后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中cAMP的含量減少，PKA催化亞單位的蛋白表達(dá)水平降低，二者均在緩激肽作用15 min時(shí)變化最明顯。 討論： 我們的研究證明，BK作用后，TJ開放，吞飲小泡數(shù)量增加，BTB的通透性顯著增加。TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin

9、和claudin-5的表達(dá)都顯著低于對(duì)照組，在BK作用15-min達(dá)最低值；并且TJ相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的分布也發(fā)生了改變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin-1的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，在BK作用15-min達(dá)峰值，而caveolin-2的表達(dá)水平?jīng)]有變化。上述結(jié)果說明，BK能夠通過開放TJ的細(xì)胞旁途徑和增加吞飲小泡數(shù)量的跨細(xì)胞途徑增加BTB的通透性。 緩激肽是生物活性物質(zhì)，小劑量BK能有效增加血腫瘤屏障

10、的通透性，而不影響正常腦組織。我們通過伊文氏蘭實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)，伊文氏蘭的通透性在BK作用15-min時(shí)達(dá)到最大值。目前關(guān)于BK是通過細(xì)胞旁還是跨細(xì)胞途徑開放BTB還不是很清楚。很多研究認(rèn)為，緩激肽主要通過跨細(xì)胞途徑增加血腫瘤屏障的通透性，Black等人應(yīng)用透射電鏡對(duì)緩激肽作用后的微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡的變化進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)緩激肽作用后吞飲小泡的數(shù)量明顯增加，我們透射電鏡的結(jié)果與其相一致，緩激肽可以使吞飲小泡的數(shù)量增加，在緩激

11、肽作用15min時(shí)吞飲小泡的數(shù)量最多。Sanovich等人在研究BK類似物RMP-7開放血腦屏障的途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，RMP-7可通過開放TJ的細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)藥物；Easton等人的體外研究也表明BK可降低內(nèi)皮細(xì)胞的TEER，從而開放緊密連接。我們應(yīng)用透射電鏡觀察BK對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠微血管TJ的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，BK作用后TJ顯著開放，在BK作用15min時(shí)開放最明顯。此外，我們的體外實(shí)驗(yàn)也證明，BK能夠降低體外BTB模型的TEER值；并且以時(shí)間依賴的

12、方式增加HRP的通透性。二者均在BK作用15main時(shí)變化最明顯。綜上所述，我們認(rèn)為，BK能夠選擇性開放BTB的TJ，增加吞飲小泡的數(shù)量，但確切的分子機(jī)制還不清楚。 為了弄清BK開放TJ的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5以及細(xì)胞骨架蛋白F-actin的分布和表達(dá)變化。ZO-1是第一個(gè)被確定的TJ相關(guān)蛋白，它是MAGUK家族(含有鳥苷酸激酶區(qū)域或GUK結(jié)構(gòu)域的一個(gè)家族)成員之一。越來(lái)越

13、多的證據(jù)顯示ZO-1的缺失會(huì)導(dǎo)致TJ結(jié)構(gòu)的破壞。Occludin是研究的最清楚的TJ跨膜蛋白，普遍認(rèn)為它直接參與TJ的屏障和柵欄功能。Claudin-5是腦內(nèi)皮細(xì)胞TJ一個(gè)主要的細(xì)胞黏附分子，他可能直接參與BBB的建立和通透性的調(diào)節(jié)。我們的結(jié)果顯示，BK能夠減少緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)水平并改變其分布，最明顯的變化出現(xiàn)在BK灌注15min時(shí)，這與EB、TEER和HRP達(dá)到峰值的時(shí)間相一致，這說明BK可通過下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、oc

14、cludin和claudin-5的表達(dá)開放TJ。最近的研究顯示，F(xiàn)-actin在TJ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)支持和功能調(diào)節(jié)中都有重要作用，從而能夠調(diào)節(jié)BBB的通透性。我們應(yīng)用熒光顯微鏡觀察F-actin的變化，結(jié)果顯示BK灌注后F-actin出現(xiàn)了明顯的解聚。大量的體內(nèi)外研究顯示，TJ相關(guān)蛋白與細(xì)胞骨架蛋白相互作用共同維持TJ的完整性。因此，我們認(rèn)為，BK可能通過影響F-actin的作用調(diào)節(jié)TJ相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而引起TJ開放。 跨細(xì)

15、胞途徑可以轉(zhuǎn)運(yùn)白蛋白大小相似或比其大的血漿蛋白，主要通過細(xì)胞表面的caveolae介導(dǎo)的囊泡載體的內(nèi)吞過程實(shí)現(xiàn)的。特定的信號(hào)可引起caveolae的內(nèi)吞，并轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮的基膜側(cè)。Caveolin-1是形成caveolae所必需的主要結(jié)構(gòu)蛋白，敲除caveolin-1后，caveolae完全缺失。此外，caveolin-1在調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸中也起重要作用，它可以通過控制信號(hào)分子的活性和定位調(diào)節(jié)囊泡的分裂、內(nèi)吞、融合和胞吐作用。為了進(jìn)一步弄清介導(dǎo)

16、緩激肽增加吞飲小泡數(shù)量的機(jī)制，我們應(yīng)用免疫組化、雙重免疫熒光和Westem blot等方法檢測(cè)了緩激肽對(duì)caveolin-1和caveolin-2的分布和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，緩激肽作用后caveolin-1在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)水平增加，在緩激肽作用15 min時(shí)達(dá)到峰值；而緩激肽對(duì)caveolin-2的表達(dá)水平?jīng)]有影響。Caveolin-1的表達(dá)水平變化與吞飲小泡變化的時(shí)程相同，由此我們認(rèn)為，緩激肽可能通過上調(diào)caveo

17、lin-1的表達(dá)水平增加吞飲小泡的數(shù)量，從而調(diào)節(jié)血腫瘤屏障的通透性。 結(jié)論： 1、緩激肽能開放緊密連接，增加吞飲小泡的數(shù)量，選擇性增加血腫瘤屏障的通透性。 2、緩激肽能使緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)減少，此作用與緩激肽誘導(dǎo)緊密連接開放有關(guān)。 3、緩激肽能促進(jìn)C6膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中caveolin-1的表達(dá)增加，caveolin-1表達(dá)的上