聚集超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）是由大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)膜、周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞足突共同組成的位于外周循環(huán)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的分界。雖然生理情況下血腦屏障保護了中樞神經(jīng)系統(tǒng)不受外來有害物質(zhì)的侵入，但是同時血腦屏障也阻止了大部分治療性藥物進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此在很長一段時間里，由于血腦屏障的存在以及開放血腦屏障方法的局限性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療發(fā)展受到了極大限制。為了克服這個難題，

2、人們嘗試了很多方法，但是他們都不能安全有效的開放血腦屏障促進治療性藥物進入腦組織。隨著低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡靶向性、可逆性、無創(chuàng)性開放血腦屏障的方法出現(xiàn)，這個局面得到了改善，該方法成為了目前開放血腦屏障最有效的方法，臨床應(yīng)用前景很廣。但是其中所涉及的機制還不完全清楚。目前的主要認(rèn)識是低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的機械效應(yīng)會作用于血腦屏障上的機械敏感性離子通道，引起大腦微血管的生化效應(yīng)，增加血腦屏障的跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑的滲透性，引起血腦屏障

3、的開放。我們的目的是首先研究在聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的過程中，參與大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞跨細(xì)胞途徑的caveolae和caveolin-1的改變情況，從而證實跨細(xì)胞途徑在該開放血腦屏障過程中的作用;其次是研究caveolin-1可能對緊密連接蛋白claudin-5的影響，探索跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑可能具有的聯(lián)系。
　　方法：
　　實驗共分為三個部分:
　　第一部分實驗共分為6個組，即對照組、FUS聯(lián)合微泡處理后0h組

4、、FUS聯(lián)合微泡處理后1h組、FUS聯(lián)合微泡處理后2h組、FUS聯(lián)合微泡處理后4h組和FUS聯(lián)合微泡處理后8h組。使用MRI增強掃描測量信號強度值和熒光分光光度計測量EB濃度兩種方法進行驗證，建立聚焦超聲聯(lián)合微泡靶向性、可逆性、無創(chuàng)性開放血腦屏障的SD大鼠模型，并確定我們建立的動物模型中血腦屏障開放的時間規(guī)律。
　　第二部分實驗共分為4個組，即對照組、單獨使用微泡組、單獨使用聚焦超聲組和聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障組。觀察cave

5、olae和caveolin-1的變化情況，并排除聚焦超聲和微泡單獨使用對他們的影響。
　　1.使用免疫組織化學(xué)實驗觀察caveolin-1在腦組織中的分布情況，并初步發(fā)現(xiàn)caveolin-1在四個組中的表達(dá)水平。
　　2.使用qRT-PCR和westem blot實驗分析四個組中caveolin-1的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　3.使用透射電鏡觀察血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)，觀察四個組中caveolae的數(shù)量變化。
　　第

6、三部分實驗分為3個組，即對照組，聚焦超聲聯(lián)合微泡組、非律平干擾組，研究非律平干擾caveolin-1后對血腦屏障滲透性和緊密連接的影響。
　　1.檢測EB染料的濃度，確定非律平干擾對血腦屏障開放的影響。
　　2.使用western blot檢測caveolin-1和claudin-5的表達(dá)情況，觀測非律平干擾后caveolin-1和claudin-5的表達(dá)改變。
　　結(jié)果：
　　1.MRI信號強度增強值在FUS聯(lián)

7、合微泡處理SD大鼠后立即增大，F(xiàn)US聯(lián)合微泡處理SD大鼠后1h時MRI信號強度增強值達(dá)到最高水平，在FUS聯(lián)合微泡處理SD大鼠后4h所測得的MRI信號強度增強值減小，而到FUS聯(lián)合微泡處理SD大鼠后8h MRI信號強度增強值恢復(fù)至正常水平。
　　2.FUS聯(lián)合微泡處理SD大鼠后腦組織中EB濃度立即升高，F(xiàn)US聯(lián)合微泡處理大鼠后1h EB濃度最高，之后EB濃度降低，當(dāng)FUS聯(lián)合微泡處理大鼠后8h，EB濃度降至正常水平。
　　3

8、.免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示caveolin-1主要在大腦微血管中表達(dá)并沿著微血管走形分布;與對照組相比，微泡組的caveolin-1表達(dá)水平無顯著性差異，而FUS組和FUS聯(lián)合微泡組有顯著性差異(p＜0.01)，并且FUS聯(lián)合微泡組的caveolin-1表達(dá)水平增高最顯著。
　　4.western blot實驗結(jié)果顯示與對照組相比，微泡組光密度值無統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)US組和FUS聯(lián)合微泡組有顯著性差異(p＜0.01)，并且FUS聯(lián)合微

9、泡組中caveolin-1蛋白表達(dá)水平增加最明顯。
　　5.qRT-PCR實驗結(jié)果顯示與對照組相比，微泡組的caveolin-1基因表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)US組和FUS聯(lián)合微泡組均有顯著性差異(p＜0.01)，并且FUS聯(lián)合微泡組的caveolin-1基因表達(dá)水平增加最顯著。
　　6.透射電鏡結(jié)果顯示在正常對照組和微泡組的SD大鼠腦組織中，caveolae的數(shù)量很少被觀察到，在FUS組的SD大鼠腦組織中，可以觀察到增多的cav

10、eolae，而在FUS聯(lián)合微泡組的SD大鼠腦組織中，可以觀察到大量增加的caveolae結(jié)構(gòu)。
　　7.使用非律平干擾后，EB濃度較未干擾組低。
　　8.干擾caveolin-1的表達(dá)會影響緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.MRI增強掃描和熒光分光光度計測定EB含量的方法得出的結(jié)果一致，我們所使用的聚焦超聲參數(shù)和微泡劑量能夠靶向性和可逆性開放血腦屏障。
　　2.聚焦超聲聯(lián)合微泡處理

11、SD大鼠后1h為最大化開放血腦屏障的時間點。
　　3.聚焦超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的機械效應(yīng)引起的血腦屏障開放效應(yīng)大于單獨使用聚焦超聲或者微泡時引起的血腦屏障開放效應(yīng)之和。
　　4.應(yīng)用免疫組織化學(xué)實驗、qRT-PCR和western blot實驗可以發(fā)現(xiàn)，聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠顯著增加大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上caveolin-1的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　5.應(yīng)用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠顯著增加大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上ca