低頻超聲與小劑量緩激肽聯(lián)合應(yīng)用開放血腫瘤屏障機(jī)制的研究.pdf

1、血腦屏障(blood—brain barrier，BBB)是維持腦內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)平衡的重要結(jié)構(gòu)，嚴(yán)格限制大分子物質(zhì)與98％的小分子物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與BBB結(jié)構(gòu)類似，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞與微血管之間存在著血腫瘤屏障(blood-Tumor barrier，BTB)，是位于內(nèi)皮細(xì)胞之間由一些復(fù)雜的緊密連接(tight junction，TJ)蛋白系統(tǒng)構(gòu)成的限制親水性物質(zhì)跨過的細(xì)胞旁屏障。TJ蛋白系統(tǒng)是由claudins、occludin和ZO—1

2、等多種TJ相關(guān)蛋白構(gòu)成的復(fù)雜連接。BTB的通透性略高于正常的BBB，但仍具有屏障的功能。BTB的存在是限制抗腫瘤藥物療效的關(guān)鍵。研究者們已經(jīng)嘗試采取多種方法提高藥物通過BTB的通透性，如使用高滲性藥物甘露醇、設(shè)計(jì)能跨過屏障的藥物或載體、直接將藥物注射入腦、用導(dǎo)管經(jīng)動(dòng)脈分支給藥、經(jīng)鼻腔給藥等，但是這些方法因受使用劑量大、有一定創(chuàng)傷性、安全性低、開放時(shí)間短等諸多條件的限制而難以得到臨床應(yīng)用。 低頻超聲(low—frequency u

3、ltrasound，LFU)是臨床診斷中的常規(guī)手段之一。由于LFU具有在組織中易穿透，聲能吸收少，對組織損傷小的特點(diǎn)，近年來，國內(nèi)外學(xué)者也開始將LFU用于實(shí)驗(yàn)性治療的研究中。LFU已經(jīng)應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)病及感染和炎癥的治療、促進(jìn)骨折愈合、溶栓、軟組織修復(fù)及抗腫瘤細(xì)胞治療等實(shí)驗(yàn)性治療研究。最近，國外研究發(fā)現(xiàn)，LFU作用于腦組織可以引起B(yǎng)BB的開放，采用的超聲頻率范圍為260 kHz～1.63 MHz，也有選用最大頻率為3.5 MHz的報(bào)道。研究

4、顯示，LFU也可以提高藥物在腦內(nèi)的通透性，但目前仍處于實(shí)驗(yàn)階段，超聲條件還沒有統(tǒng)一的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。我們的前期研究工作表明，在1 MHz、12 mW、聲壓0.48 Mpa和作用時(shí)間為20 s的條件下進(jìn)行LFU輻照能夠可逆性開放BBB的同時(shí)，對正常神經(jīng)元沒有產(chǎn)生明顯損傷。考慮到腫瘤術(shù)后骨窗，便于超聲輻照，上述研究提示LFU有可能成為研究可逆性開放BTB的新方法。目前關(guān)于LFU開放BBB或BTB的機(jī)制尚不清楚。 有報(bào)道灌注小劑量緩激肽(b

5、radykinin，BK)可能通過與膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的B2受體結(jié)合，選擇性開放BTB，增加抗腫瘤藥物卡鉑到達(dá)腦腫瘤組織，有效延長腦惡性膠質(zhì)瘤的生存期。但是，研究發(fā)現(xiàn)，BK還有一些缺點(diǎn)，如劑量較大時(shí)有明顯的降血壓作用，并且由于BK可被快速降解，使得其增加BTB通透性的時(shí)間很短暫，因而臨床應(yīng)用受限。因此，探尋提高緩激肽作用效果和時(shí)間的方法是目前的研究方向。 本研究嘗試單獨(dú)應(yīng)用LFU輻照，或者LFU和小劑量BK聯(lián)合應(yīng)用的方法，研究對BTB

6、通透性的影響，以及開放BTB細(xì)胞旁途徑的機(jī)制；同時(shí)研究二者單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，三種BTB的TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化，探討其可能的機(jī)制，并力圖尋求安全、較長效地開放BTB的二者聯(lián)合應(yīng)用的劑量。 方法： 1、建立有超聲透聲窗的大鼠BTB模型。 2、應(yīng)用伊文氏蘭(Evans blue，EB)滲透法檢測LFU與BK單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB滲透性的變

7、化。 3、應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察LFU與BK單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用前后腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞間TJ及腦膠質(zhì)瘤等超微結(jié)構(gòu)的改變。 4、應(yīng)用RT-PCR法檢測LFU與BK單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表達(dá)的變化。 5、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測LFU與BK單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的分布和表達(dá)的變化。

8、 6、應(yīng)用免疫熒光法檢測LFU與BK單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的分布和表達(dá)的變化。 7、應(yīng)用western blot法檢測LFU與BK單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1、 LFU輻照后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠的BTB通透性增加，在1.5 h達(dá)到峰值，12 h恢復(fù)正常水平。

9、 2、 LFU輻照引起C6腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ開放；對神經(jīng)元無明顯損傷，同時(shí)誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。 3、 LFU輻照后，TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表達(dá)顯著減少；其減少的趨勢為在1.5 h時(shí)達(dá)最低值，12 h以后逐漸恢復(fù)正常。 4、LFU輻照后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和2O—1的表達(dá)減少；其減少的趨勢為在1.

10、5 h時(shí)達(dá)最低值，12 h以后逐漸恢復(fù)正常。 5、LFU與BK單獨(dú)應(yīng)用后，BTB的通透性顯著增加；二者聯(lián)合應(yīng)用后，BTB通透性進(jìn)一步增加。 6、 LFU與BK單獨(dú)與聯(lián)合應(yīng)用后，透射電鏡均可顯示C6腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ開放。 7、 LFU與BK單獨(dú)應(yīng)用后，TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表達(dá)顯著減少；二者聯(lián)合應(yīng)用后TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表

11、達(dá)進(jìn)一步顯著減少。 8、 LFU與BK單獨(dú)應(yīng)用后，TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的蛋白表達(dá)顯著減少；二者聯(lián)合應(yīng)用后TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的蛋白表達(dá)進(jìn)一步顯著減少。 結(jié)論： 1、超聲參數(shù)為頻率1 MHz、強(qiáng)度12 mW、聲壓0.48 Mpa和作用時(shí)間20s的LFU是可逆性地開放BTB的適宜條件。 2、LFU在顯著地增加BTB的通透性的同時(shí)，能

12、可逆性地開放BTB的TJ；LFU在開放BTB的條件下對神經(jīng)元無明顯損傷，能夠誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。 3、LFU輻照能使TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著減少，此作用與LFU誘導(dǎo)TJ開放相關(guān)。 4、LFU與BK聯(lián)合應(yīng)用能以協(xié)同作用的方式顯著增加BTB的通透性。 5、LFU與BK聯(lián)合應(yīng)用能以協(xié)同作用的方式顯著減少TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和