血腫瘤屏障體外模型的建立及天然冰片對其調控的效果和機制研究.pdf

1、目的:
　　通過建立體外血腫瘤屏障模型(blood-tumor barrier，BTB)，研究天然冰片開放血腫瘤屏障模型的時效、量效關系及對緊密連接蛋白的調控作用;進一步結合在體動物模型上，研究天然冰片提高抗腫瘤藥物透過血腫瘤屏障的藥效學研究，闡明天然冰片調節(jié)血腫瘤屏障開放的效果和機制，為臨床上神經膠質瘤等顱內疾病的治療開辟一條新的途徑。
　　方法:
　　1.體外BTB細胞模型的建立
　　大鼠C6膠質瘤細胞和人臍

2、靜脈內皮細胞(HUVEC)非接觸共培養(yǎng)建立體外BTB細胞模型，采用內皮細胞跨膜阻抗(TEER)及HRP流量對模型性能進行評價。
　　2.天然冰片藥材中右旋龍腦的含量測定
　　采用氣相色譜法測定天然冰片藥材中右旋龍腦的含量。GC條件為:色譜柱:ZB-WAX毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm);柱溫:梯度升溫，90℃保留2min，以10℃/min上升至110℃，保留2min，以30℃/min上升至160℃，保留2min

3、;進樣口:210℃;FID檢測器溫度:250℃;高純氮氣壓力:5psi;分流比:10∶1;空氣流速:450mL/min;氫氣流速:45mL/min;進樣量:1μL。
　　3.天然冰片對體外血腫瘤屏障模型通透性及緊密連接相關蛋白表達的影響
　　實驗分4組:空白對照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組（100μg/mL），每組3個復孔。HRP流量測定不同劑量天然冰片對體外BTB細胞模型

4、通透性的影響:免疫熒光及ELISA方法測定Claudin-5、Occludin、ZO-1、F-actin的蛋白表達及分布變化。
　　4.大鼠C6腦膠質瘤在體模型的制備
　　SD大鼠禁食不禁水12h，10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，腦右側尾狀核狀處注射C6膠質瘤細胞2.5×106（25μL），無菌骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚，切口消毒，常規(guī)飼養(yǎng)。
　　5.天然冰片對甲氨蝶呤在C6腦膠質瘤模型大鼠體內藥動學及腦組

5、織分布的影響
　　制備成功的C6腦膠質瘤模型大鼠隨機分為溶媒對照組（0.5％羧甲基纖維素鈉）、冰片低劑量組(35mg/kg)、冰片高劑量組(140mg/kg)，每組28只。灌胃給藥(10mL/kg)，1h后，3組大鼠均尾靜脈注射甲氨蝶呤(20mg/kg)。于甲氨蝶呤注射后的不同時間點取血及腦腫瘤組織，每個時間點血漿和腦組織的樣本均為4只大鼠。
　　色譜條件:色譜柱:Synergi Hydro-RP C18(250mm×4.6

6、mm，4μm);流動相:甲醇-0.3％冰醋酸/0.25％三乙胺溶液(26:74);流速:1mL/min;自動進樣器溫度:4℃;柱溫:35℃;檢測波長:302nm。
　　結果:
　　1.成功建立了體外BTB細胞模型，較好地反映了體內的情況，可用于模擬體內環(huán)境，用于藥物跨血腫瘤屏障特性方面的研究。
　　2.本實驗所使用的天然冰片中右旋龍腦含量達到97.027％，符合中國藥典2010年版一部規(guī)定，可用于后續(xù)實驗研究。

7、　　3.HRP流量測定天然冰片對體外BTB細胞模型通透性的影響，結果顯示:與空白對照組相比，天然冰片低劑量組(25μg/mL)、中劑量組（50μg/mL）、高劑量組（100μg/mL）的HRP通透率均隨著作用時間的延長逐漸提高，其中與空白組各相應時間點相比天然冰片低劑量組在10、30、60、120、240min時，通透率明顯提高，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);中、高劑量組全部時間點的通透率明顯高于空白組各相應時間點的通透率，具有統(tǒng)計學

8、意義;從不同組同一時間點的通透率可以看出，呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，高劑量組（各時間點通透率）＞中劑量組（各時間點通透率）＞低劑量組（各時間點通透率）。從相鄰時間點的透過率差值分析，低、中、高劑量組均在10-30min、30-60min時，HRP透過率提升最明顯，60-120min時通透率增加幅度降低，120-240min時，通透率恢復正常水平。
　　4.ELISA方法及免疫熒光法測定體外血腫瘤屏障上緊密連接相關蛋白Claudin-5、O

9、ccludin、ZO-1、F-actin的表達變化。ELISA測定結果顯示:Claudin-5蛋白的表達量隨作用時間的延長先降低，然后又逐漸升高恢復至藥前水平，在30min時表達量最低，并且在30、60min時間點存在劑量依賴性，高劑量（Claudin-5）＜中劑量(Claudin-5)＜低劑量(Claudin-5)＜藥前（Claudin-5）。Occludin蛋白不同時間點間及不同組別間沒有顯著性的變化，表明天然冰片在25μg/mL-

10、100μg/mL劑量范圍內，作用于BTB細胞模型4h，對Occludin蛋白的表達沒有顯著性的影響(P＞0.05)。天然冰片低劑量給藥后，ZO-1蛋白各時間點的表達量與給藥前相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);中、高劑量組ZO-1蛋白表達量先降低后又逐漸升高，且分別在60、30min時表達量最低(P＜0.01)。F-actin蛋白，各組表達量均先降低后逐漸升高，在30、60min時各組蛋白量顯著低于藥前表達量，差異具有統(tǒng)計學意義，并在

11、30、60min時各組F-actin蛋白量存在劑量依賴趨勢高劑量（F-actin）＜中劑量(F-actin)＜低劑量(F-act＜藥前(F-actin)。免疫熒光法測定的四個蛋白的表達變化與ELISA實驗結果基本一致。
　　5.成功制備大鼠C6腦膠質瘤模型，并建立了測定血漿及腦組織勻漿液中甲氨蝶呤含量的HPLC法。與溶媒對照組比較，冰片高、低劑量組血漿中甲氨蝶呤AUC0-t，AUC0-∞均顯著降低(P＜0.01);冰片高劑量組腦腫

12、瘤組織中甲氨蝶呤AUC0-t，AUC0-∞顯著升高(P＜0.05)，冰片低劑量組腦腫瘤組織中甲氨蝶呤AUC0-t，AUC0-∞亦有升高趨勢，但與溶媒對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　結論
　　天然冰片通過調控相關緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的表達和分布的改變，從而調節(jié)體外BTB細胞模型的通透性;在體實驗進一步驗證了天然冰片能夠調節(jié)血腫瘤屏障的通透性，提高提高抗腫瘤藥物甲氨蝶呤的腦組織生物