基于血腦屏障Claudins基因調(diào)控的冰片、麝香酮-開竅-機制研究及安全性評價.pdf

1、目的:研究中藥開竅藥冰片和麝香酮對斑馬魚血腦屏障超微結(jié)構(gòu)及其緊密連接蛋白Claudins表達的影響,以闡明冰片和麝香酮開啟血腦屏障的機制。利用斑馬魚胚胎對冰片和麝香酮的安全性進行評價。
　　方法:給成年斑馬魚腹腔注射麝香酮(給予冰片后血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的觀察之前的研究者已做過),利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化;實時熒光定量PCR和整體原位雜交技術(shù)探討冰片和麝香酮對斑馬魚緊密連接蛋白Claudins表達的影響以及下調(diào)明顯

2、基因不同時間點表達的變化。受精后3h(3hpf)斑馬魚在含冰片和麝香酮不同濃度的胚胎養(yǎng)殖水液暴露,在8,24,48,72和96hpf用顯微鏡觀察胚胎發(fā)育形態(tài),測定24hpf自主抽動次數(shù),48hpf心率、孵化率、畸形率和死亡率,RT-qPCR法檢測96hpf胚胎sepn1基因表達的情況。
　　結(jié)果:在給予麝香酮后,BBB的基膜出現(xiàn)斷裂,膨大的現(xiàn)象,緊密連接結(jié)構(gòu)疏松,內(nèi)皮細胞出現(xiàn)皺縮,隨著給藥時間的增長,BBB疏松越明顯(與冰片結(jié)果一

3、致);冰片或麝香酮作用1h后,大部分基因表達下調(diào),其中Claudin-5a,-12在冰片中下調(diào)明顯,Claudin-2,-5a,-7b在麝香酮中下調(diào)明顯。Claudin-5a在冰片作用后,1h下調(diào)最為明顯,6h后表達恢復。麝香酮作用的4h之間,Claudin-2,-5a,-7b表達先短暫上調(diào),后下調(diào),1h下調(diào)最顯著,然后又恢復,其中Claudin-5a在4h時恢復至正常水平。冰片和麝香酮對斑馬魚胚胎24hpf時自主抽動次數(shù),48hpf心

4、率,孵化率,畸形率,死亡率都存在不同程度的影響;48hpf以后都出現(xiàn)脊柱彎曲、心囊水腫、卵黃囊水腫,游泳異常的毒性癥狀;冰片使胚胎的sepn1基因表達上調(diào)(P<0.05)。麝香酮使 sepn1基因表達明顯下調(diào)(p<0.01)。
　　結(jié)論:冰片和麝香酮能使緊密連接蛋白Claudins家族基因表達下調(diào),致使緊密連接結(jié)構(gòu)疏松,加之基膜結(jié)構(gòu)破壞,內(nèi)皮細胞皺縮,使得血腦屏障的屏障作用減弱,從而開啟血腦屏障?；蚩赡嫘缘南抡{(diào)說明冰片和麝香酮對