毛竹抗病PheWRKY1基因的克隆與功能分析.pdf

1、植物在長期進化過程中形成了一個復雜的調控體系來抵御病害脅迫的影響，包括本身保護性生理屏障以及一系列抗病相關基因的誘導表達。僅存在于植物中的WRKY轉錄因子基因，構成轉錄因子超家族，廣泛參與植物抗逆反應以及多種生理代謝過程。為了探討WRKY轉錄因子基因在毛竹中的作用，本研究從毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了一個PheWRKY1基因，對其編碼蛋白的氨基酸序列及其表達特性進行了分析，并將其在擬南芥(Arabidopsi

2、s thaliana)中增強表達，對所獲得的轉基因株系的抗病性進行了初步研究。
　　通過RT-PCR技術，克隆得到PheWRKY1基因。序列分析表明，該基因全長1080 bp，包括一個579 bp開放閱讀框，編碼一個由193個氨基酸組成的蛋白質，相對分子量為20.8 KDa，等電點為5.99，基因注冊號為GU944762。序列分析表明，PheWRKY1基因的氨基酸序列含一個WRKY結構域和一個鋅指結構C2H2，屬于WRKYⅡ亞組。

3、PheWRKY1基因編碼蛋白的保守元件與禾本科植物甘蔗、水稻、小麥、黑麥草等有很高的一致性，在86％以上，與擬南芥中AtWRKY51同源性達47%。經(jīng)生物信息學軟件預測得知，PheWRKY1蛋白定位于細胞核內，蛋白的三級結構與禾本科植物黑麥草類似，并且該蛋白具有轉錄調控和信號轉導等功能。
　　對毛竹實生苗進行多種脅迫和誘導處理，提取葉片總RNA，用實時定量PCR方法分析目的基因表達模式。結果表明，外施抗病信號分子水楊酸（SA）和茉

4、莉酸（JA）均可以誘導PheWRKY1增強表達，但前者增強幅度更大，保持時間更長；紫外線B輻射也能誘導基因增強表達；外施脫落酸（ABA）和干旱脅迫，PheWRKY1表達無明顯變化。野外毛竹林中感染毛竹叢枝病與枯稍病樣本中 PheWRKY1基因表達也有所增強。提示PheWRKY1可能通過水楊酸和茉莉酸轉導途徑參與病原菌誘導的信號傳遞，而不參與對滲透脅迫的反應。
　　為研究PheWRKY1基因能否與順式作用元件的W盒結合，構建了Phe

5、WRKY1基因的原核表達載體，將其轉入pET-28a，并使重組質粒pET-WRKY在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導得到了有效的異源表達。
　　對PheWRKY1基因構建植物過表達載體并轉化模式植物擬南芥，目前已經(jīng)得T2代轉基因株系。轉基因植株表現(xiàn)出不同的形態(tài)學特征，根系發(fā)達、葉片肥大、莖粗壯，提前開花且結種不良，推測PheWRKY1基因的過表達影響了轉基因株系的生長發(fā)育。
　　為進一步分析 PheWRKY1基因是否調控植物抗病反應

6、，本實驗用丁香假單胞菌Pseudomonas syringae PV Tomato DC3000(簡稱DC3000)侵染擬南芥，各實驗材料在1d會出現(xiàn)小的病斑，然后病斑會向四周擴散。但隨后轉基因株系的病斑被局限在一個區(qū)域內，周圍無明顯黃化壞死組織，而野生型的病斑會一直擴散，周圍黃化，直至整片葉卷曲甚至枯萎。轉基因株系被侵染的整片葉以及剩余健康區(qū)域的Fv/Fm值和ΦPSⅡ值都高于野生植株。Y(NO)、Y(Ⅱ)、Y(NPQ)三個葉綠素熒光參

7、數(shù)值的比例變化也存在差異，表現(xiàn)在被侵染的野生型植株的Y(NO)增長幅度高于被侵染的轉基因株系，由于三者之和為1，因此導致野生型植株后兩值的下降幅度也高于轉基因株系。這就意味著被侵染的轉基因株系整體光合性能和利用同等光強的能力優(yōu)于被侵染的野生型植株。病原菌侵染下PheWRKY1基因所調控的下游抗病相關基因的表達發(fā)生了變化。熒光定量PCR結果顯示，在被侵染葉片和未被侵染葉片中，轉基因和野生植株的抗病相關基因PR1，PR2，PR5，NPR1表