蘋果斑點(diǎn)落葉病抗病基因Mal d 1的克隆及功能分析.pdf

1、蘋果斑點(diǎn)落葉病作為嚴(yán)重的真菌病害，每年會(huì)對(duì)我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重要影響。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)該病的研究主要集中于防治方法、病原菌鑒定、抗病品種的選育等，但對(duì)其抗病機(jī)理并不明確。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果葉片受斑點(diǎn)落葉病、黑星病、火疫病脅迫后，可誘導(dǎo)Mald1基因表達(dá)參與防御反應(yīng)，但其在蘋果防御反應(yīng)過(guò)程中的具體作用還需進(jìn)一步挖掘。鑒于蘋果抗病基因挖掘的重要意義，本研究克隆了抗病相關(guān)Mald1基因，初步完成了其功能鑒定，解析了Mald1基因在蘋果抗病

2、過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)，研究結(jié)果將為進(jìn)一步開(kāi)展蘋果抗病新種質(zhì)的遺傳改良和定向選育提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。
　　本文以‘王林’蘋果葉片為試材，克隆得到Mald1基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析、表達(dá)特性分析、轉(zhuǎn)基因植物材料抗病性鑒定、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)等方法對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步研究，獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Mald1開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為480 bp，編碼159個(gè)氨基酸殘基，包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，預(yù)測(cè)由1

3、9種已知氨基酸組成，分子量約為17.62kD，等電點(diǎn)為5.68，脂肪族指數(shù)為82.26，不穩(wěn)定指數(shù)為31.80，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。利用PSORT Prediction工具對(duì)蘋果Mal d1蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位，推測(cè)蘋果Mal d1蛋白極有可能存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。根據(jù)Mal d1蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型可知:可能構(gòu)成α螺旋結(jié)構(gòu)的推測(cè)有35個(gè)氨基酸、構(gòu)成β折疊結(jié)構(gòu)的推測(cè)有48個(gè)氨基酸、構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲的推測(cè)有76個(gè)氨基酸。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量

4、PCR分析結(jié)果顯示，Mal d1在蘋果葉、花、果皮、果肉中均有表達(dá)，但各器官中表達(dá)水平存在差異;在不同發(fā)育時(shí)期的果皮中都有表達(dá)，表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì);在不同品種葉片中均有表達(dá)，特別是抗性品種葉片中表達(dá)水平較高;在葉片人工接種病菌條件下表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯高于對(duì)照組。上述結(jié)果表明Mal d1基因參與植物與病原菌的互作。
　　3.利用PRI101-AN載體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因愈傷組

5、織抗病鑒定，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)Mald1基因的愈傷組織相較未轉(zhuǎn)基因的愈傷組織，發(fā)病晚、癥狀輕、病菌發(fā)展速度慢。
　　4.將Mald1基因與原核表達(dá)載體pColdⅡ連接，經(jīng)測(cè)序確定所構(gòu)建的重組載體pCold-Mal d1開(kāi)放閱讀框正確。將獲得的重組質(zhì)粒pCold-Mal d1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)冷誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳檢測(cè)，證明Mald1蛋白獲得了穩(wěn)定而高效的表達(dá)，所表達(dá)蛋白是大小約為22.4 kD的融合蛋白，后經(jīng)鎳柱