毛竹紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的克隆與功能研究.pdf

1、適應各種光照環(huán)境是植物生存的本能，葉黃素循環(huán)在植物適應強光環(huán)境、光破壞防御和適應低光環(huán)境、提高光能利用效率過程中都發(fā)揮著重要作用。葉黃素循環(huán)含有三種組分，即紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)。當植物吸收的光能超過其轉(zhuǎn)化能力時，類囊體腔被過度酸化，低pH能夠激活紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶，催化紫黃質(zhì)生成玉米黃質(zhì)的反應。玉米黃質(zhì)能夠?qū)⑦^量光能以熱能的形式耗散掉，而且能夠清除一些氧自由基，以減輕過量光能對植物產(chǎn)生的傷害。而在低光照下，玉米黃質(zhì)在玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶

2、的作用下轉(zhuǎn)化為紫黃質(zhì)，減少光能的熱耗散，從而提高植物的光能利用率。毛竹（Phyllostachys edulis）是分布于我國亞熱帶地區(qū)的散生竹種，具有較高的經(jīng)濟價值。本論文以毛竹實生苗為材料，在研究葉片葉綠素熒光動力學參數(shù)的基礎上，開展了毛竹葉黃素循環(huán)關鍵酶-紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶的研究，以期為認識竹子葉黃素循環(huán)在不同光照環(huán)境中的作用提供分子生物學基礎，主要研究結(jié)果如下：
　　第一，毛竹葉片葉綠素熒光動力學研究。利用葉綠素熒光技術，研

3、究了毛竹實生苗葉片葉綠素熒光參數(shù)非光化學猝滅（NPQ）和電子傳遞速率（ETR）的變化規(guī)律。結(jié)果表明，充分暗適應后，隨著光合有效輻射（PAR）逐漸增強，NPQ也隨之增加，而ETR則呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢。其表明NPQ在過量光能熱耗散過程中發(fā)揮重要作用。
　　第二，基因克隆。將不同物種的紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶（VDE）同源蛋白序列進行比對，設計簡并引物，擴增得到毛竹VDE基因的部分cDNA序列，再通過RACE方法，獲得5′和3′端序列，經(jīng)

4、拼接獲得了基因全長cDNA（1723 bp），編碼區(qū)為1356 bp，共編碼451個氨基酸（其中N端的103個氨基酸為轉(zhuǎn)運肽），該基因命名為PeVDE。根據(jù)PeVDE的編碼區(qū)序列設計引物，以基因組DNA為模板進行擴增，經(jīng)測序結(jié)果表明毛竹PeVDE基因編碼區(qū)基因組序列含有4個內(nèi)含子和5個外顯子。
　　第三，基因的原核表達。將編碼 PeVDE成熟蛋白的基因序列克隆入原核表達載體pET-32b中，得到含有目的基因的重組表達載體。將該表達

5、載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株（Rosetta-gamin B(DE3)）感受態(tài)細胞，進行原核誘導表達。通過優(yōu)化誘導條件，在30℃條件下，0.4 mmol·L-1IPTG誘導4 h，獲得了表達豐度較高的可溶蛋白。
　　第四，酶活性測定。通過超聲破碎細菌，提取PeVDE重組總蛋白，以紫黃質(zhì)為反應底物，在25℃、pH5.1條件下暗處反應15 min，應用HPLC法檢測反應產(chǎn)物。結(jié)果顯示，反應產(chǎn)物中除了有紫黃質(zhì)外，還有花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)組分，

6、由此證明重組蛋白具有生物學活性，能夠?qū)⒆宵S質(zhì)依次轉(zhuǎn)化為花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)。
　　第五，Western blotting分析。用原核表達所得的重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。分別提取毛竹實生苗的根、莖、葉鞘和葉片組織的總蛋白，并通過SDS-PAGE進行分離，以PeVDE的多克隆抗體為探針進行檢測。Western Blotting結(jié)果表明，在莖、葉鞘和葉片中都能檢測到PeVDE，其中以葉片中含量最高，其分子量約為50 kDa