生姜紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因（GVDE）的克隆、表達(dá)、功能及其調(diào)控.pdf

1、生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是姜科、姜屬能形成地下肉質(zhì)根莖的栽培種，為多年生草本植物，作一年生蔬菜栽培。原產(chǎn)于我國(guó)及東南亞等熱帶森林及雨林區(qū)，長(zhǎng)期系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果使其形成了耐蔭不耐強(qiáng)光的特性。在強(qiáng)光下特別是晴天中午生姜植株的Pn、AQY、Fv/Fm下降。同時(shí)生姜的生長(zhǎng)季節(jié)在夏秋兩季，是一年四季中光照最強(qiáng)的時(shí)期，喜溫而不耐強(qiáng)光的生姜生長(zhǎng)在這樣的季節(jié)容易發(fā)生光抑制現(xiàn)象，甚至光氧化。在光抑制過(guò)程中生姜自身有一定的保護(hù)機(jī)

2、制。本論文以山東萊蕪生姜為試材，克隆了生姜體內(nèi)的VDE基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，研究其在強(qiáng)光下的表達(dá)；并對(duì)生姜葉片進(jìn)行外源AsA、ABA處理，研究了兩者對(duì)生姜葉片光抑制的保護(hù)作用，獲得如下結(jié)果： 1利用GenBank上已經(jīng)登陸的紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR方法克隆了生姜體內(nèi)GVDE基因的中間保守序列。然后利用RACE-PCR方法得到GVDE基因的3'和5'末端。根據(jù)已經(jīng)獲得的基因序

3、列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了GVDE基因全長(zhǎng)。測(cè)序結(jié)果表明，GVDE基因的全長(zhǎng)序列為2000bp，編碼區(qū)長(zhǎng)為1431bp，編碼476個(gè)氨基酸，分子量是53.7KD，其氨基酸序列和擬南芥，煙草，小麥，水稻分別有61％、59％、59％、63％同源性，且具有典型的VDE特征。 2運(yùn)用RT-PCR方法，從生姜總RNA中擴(kuò)增出GVDE基因的開(kāi)放閱讀框(ORF,OpenReadingFrame)1431bp，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切，將GVDE-ORF

4、連接到PBI121表達(dá)載體上，經(jīng)過(guò)雙酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)GVDE基因的ORF區(qū)已經(jīng)反向插入到表達(dá)載體上。然后將構(gòu)建好地表達(dá)載體(含目的片段)通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法侵染煙草葉片，利用抗生素篩選得到轉(zhuǎn)基因煙草植株。轉(zhuǎn)基因煙草先通過(guò)PCR-Southern排除轉(zhuǎn)基因的假陽(yáng)性，然后對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中的VDE表達(dá)和在強(qiáng)光下的保護(hù)機(jī)制作了進(jìn)一步研究，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的NPQ和Fv/Fm都低于對(duì)照，APX、SOD和POD等抗氧化酶活性也低于對(duì)照植株。

5、 3強(qiáng)光照射下不同濃度AsA處理對(duì)生姜離體葉片光抑制的作用研究。結(jié)果表明，較低濃度的AsA處理(10，50，100mM)葉片的Fv/Fm普遍高于高濃度的AsA處理(150，250mM)和對(duì)照。10mMAsA處理葉片的qP值始終高于對(duì)照，所有AsA處理qN都明顯高于對(duì)照。不同的AsA處理各抗氧化酶活性有所差異。在所有的AsA處理中以10mMAsA濃度處理對(duì)離體葉片最佳，F(xiàn)v/Fm、qP和qN維持較高水平，抗氧化酶活性也較高。說(shuō)明外源AsA

6、對(duì)強(qiáng)光引起的葉片的光抑制有一定的保護(hù)作用。 不同AsA濃度處理后的生姜活體葉片的NPQ、Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和D值普遍高于對(duì)照，AsA處理葉片的葉黃素循環(huán)庫(kù)(A+Z+V)總量也高于對(duì)照，較高濃度(150mM，250mM)的AsA處理的(A+Z)/(A+Z+V)、抗氧化酶活性等高于其它處理和對(duì)照?？偟膩?lái)說(shuō)，在所有的AsA處理中，以250mMAsA處理對(duì)活體葉片表現(xiàn)最好，熱耗散能力增強(qiáng)，抗氧化酶活性較高，能夠在一定程度上保護(hù)生

7、姜葉片在遭遇強(qiáng)光脅迫下光合機(jī)構(gòu)受過(guò)剩光能的破壞，活性氧清除能力加強(qiáng)。 4在強(qiáng)光條件下，經(jīng)不同濃度ABA處理生姜離體葉片的Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ比對(duì)照有所提高，APX、DHAR、SOD和POD等抗氧化酶活性比對(duì)照也有所增加。在所有的ABA處理中以10μMABA濃度處理為最佳，F(xiàn)v/Fm，ΦPSⅡ維持較高水平，熱耗散能力增強(qiáng)，APX、DHAR活性也較高。 以生姜活體葉片為試材，用不同ABA濃度處理后的研究結(jié)果表明，無(wú)論