紅色紅曲菌交替氧化酶基因Mraox1克隆與功能初步研究.pdf

1、在高等植物,大部分真菌和一些原生動(dòng)物中存在2條電子呼吸鏈:細(xì)胞色素途徑和交替途徑。交替途徑對氰化物不敏感,因此該途徑又被稱為抗氰途徑,交替氧化酶是交替途徑的末端氧化酶。交替途徑與細(xì)胞色素途徑在泛醌處分支,由交替氧化酶催化,泛醌將電子直接傳遞給氧化生成水,釋放熱量,不產(chǎn)生ATP。
　　 本研究從紅色紅曲菌(Monascus ruber)M-7中克隆得到了交替氧化酶基因(alternative oxidase from Monasc

2、us ruber,Mraoxl),及其上下游部分序列,構(gòu)建了Mraoxl的敲除載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo),將敲除載體轉(zhuǎn)入紅曲菌M-7,篩選得到一株ΔMraoxl突變子,并對這一株突變子進(jìn)行了抗逆性分析和表達(dá)調(diào)控的初步分析。具體結(jié)果如下:
　　 1.Mraoxl基因的克隆及序列分析
　　 根據(jù)已報(bào)道的aox基因的核酸序列和其編碼的氨基酸序列,設(shè)計(jì)了簡并引物,擴(kuò)增得到了Mraoxl基因的一段DNA序列。在此基礎(chǔ)上,采用SON-PC

3、R獲得了Mraoxl基因的編碼區(qū)及其上游和下游部分序列共4223bp,包括開放讀碼框1198bp,5’非編碼序列2329bp和3’非編碼序列696bp。經(jīng)軟件分析和預(yù)測,Mraoxl基因的開放讀碼框包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。預(yù)測編碼序列上游含有一個(gè)CRE-like元件和兩個(gè)鋅指蛋白結(jié)合位點(diǎn)。MraoxJ基因共編碼350個(gè)氨基酸。其氨基酸序列與其他絲狀真菌的AOX序列有很高的相似性,含有與雙鐵中心形成有關(guān)的EXXH和EEE-Y保守域。軟

4、件預(yù)測Mraoxl基因的編碼氨基酸序列的N端的59個(gè)氨基酸為線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
　　 2.Mraoxl基因的敲除
　　 以潮霉素抗性基因(hph)為篩選標(biāo)記,構(gòu)建Mraoxl基因的敲除載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),對紅曲菌M-7進(jìn)行了兩次轉(zhuǎn)化,獲得205株轉(zhuǎn)化子。通過對140株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行經(jīng)PCR篩選和southern

5、雜交驗(yàn)證,分離得到一株ΔMraoxl突變子。
　　 3.Mraoxl功能的初步分析
　　 3.1 H2O2、高溫、pH值和滲透壓對ΔMraoxl和M-7的孢子萌發(fā)率的影響
　　 為分析Mraoxl是否參與環(huán)境應(yīng)激過程,將105個(gè)/mL的△Mraoxl和M-7的孢子液進(jìn)行H2O2、高溫、不同pH值和滲透壓的處理,分析它們孢子萌發(fā)率的變化。10、20和30mmol/L的H2O2水溶液處理5h后,△Mraoxl的孢子萌

6、發(fā)率較M-7分別低49％、42％和25％。40℃和50℃水浴處理1、2和3h后,ΔMraoxl的孢子萌發(fā)率均低于M-7,其中40℃處理2h時(shí),差異值達(dá)到最大,為18％。經(jīng)pH8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液處理2、4和6h后,△Mraoxl突變子的孢子萌發(fā)率較M-7低,其中處理4h時(shí),差異最大,為29％。經(jīng)0.2、0.5和0.8mol/L的NaCl溶液處理之后24h后,△Mraoxl與M-7的孢子萌發(fā)率無顯著差異。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測