紅色紅曲菌pksCT基因缺失株的構(gòu)建及其固液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的研究.pdf

1、紅曲菌是我國重要的微生物資源，紅曲中含有的色素是一種優(yōu)良的著色劑，在現(xiàn)代食品加工行業(yè)發(fā)揮著重要作用，具有很高的商業(yè)價值。但是由于紅曲菌產(chǎn)桔霉素問題的存在，對紅曲的安全性提出了懷疑。本文利用pksCT置換型打靶載體敲除紅色紅曲菌Mr11中合成桔霉素的pksCT基因，獲得一株遺傳穩(wěn)定高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的pksCT基因缺失株紅曲菌，并以該菌進行固液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的研究。主要研究內(nèi)容如下： 1、利用原生質(zhì)體PEG介導轉(zhuǎn)化將置換型打靶載

2、體pHD116轉(zhuǎn)入紅色紅曲菌(Monascus ruber)Mr11中，敲除了Mr11中的pksCT基因，采用潮霉素抗性篩選和基因組DNA的PCR擴增法篩選，獲得一株pksCT基因缺失株紅曲菌Mr11k，其桔霉素表達量比原始菌株降低了99％，同時紅曲色素的產(chǎn)量提高了16.6％。 2、以獲得的pksCT基因缺失株紅曲菌Mr11k為發(fā)酵菌株，采用響應面優(yōu)化法優(yōu)化出產(chǎn)高色價紅曲米的固態(tài)發(fā)酵條件：培養(yǎng)基初始水分含量32.5％、溫度30℃

3、、發(fā)酵16 d。在此條件下紅曲米色價可達到5120 U/g，超過相關(guān)的紅曲米國家標準一級品540％，且在紅曲米中未檢出含有桔霉素(HPLC法的最低檢測限50ng/mL)。 3、采用單因素實驗、Plackett-Burman實驗和Box-Behnken響應面實驗優(yōu)化得到了紅曲菌Mr11k高產(chǎn)紅曲色素的最優(yōu)培養(yǎng)基：大米粉5％、NaNO30.2％、KH2PO40.05％、K2HPO40.1％、MgSO4.7H2O0.1％。以最優(yōu)培養(yǎng)基

4、為條件，采用單因素實驗優(yōu)化得到最優(yōu)發(fā)酵條件：種子液種齡72 hr，接種量6％，發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)時間144 hr，培養(yǎng)基初始pH6.7，裝液量40 mL/250 mL，在此條件下Mr11k的發(fā)酵液色價達170.6 U/mL，桔霉素含量為2.8μg/mL。 4、以搖瓶發(fā)酵優(yōu)化出的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，進行了紅曲菌Mr11k液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的5L發(fā)酵罐小試實驗，通過實驗確定了通氣量2 sL/min、攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min、