條件性敲除海馬CA1區(qū)DNMT3A和DNMT1的表達對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機制探討.pdf

1、Dnmt1和Dnmt3a是兩種主要的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶。近期大量研究提示Dnmt1和Dnmt3a介導(dǎo)的甲基化修飾對成熟神經(jīng)系統(tǒng)的功能（如學(xué)習(xí)和記憶）具有重要的調(diào)節(jié)作用。為進一步研究DNA甲基化對海馬神經(jīng)元突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶的影響并對其可能的機制進行探討，我們首先通過腦立體定位及微量注射的方法將表達Cre重組酶和綠色熒光蛋白GFP的腺相關(guān)病毒(AAV-Cre-2A-GFP)顆粒懸液導(dǎo)入Dnmt12flox/2flox Dnmt3a2fl

2、ox/2flox小鼠海馬的CA1區(qū)，通過Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)實現(xiàn)對CA1區(qū)成熟神經(jīng)元內(nèi)Dnmt1和Dnmt3a基因的在體時空特異性共敲除。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合一系列行為學(xué)實驗，來觀察海馬CA1區(qū)成熟神經(jīng)元內(nèi)條件性Dnmt1和Dnmt3a基因共敲除對小鼠海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的影響。同時，我們用AAV-Cre-2A-GFP病毒顆粒感染原代培養(yǎng)的Dnmt12flox/2flox Dnmt3a2flox/2flox小鼠海馬神經(jīng)元，以實現(xiàn)對神經(jīng)元

3、內(nèi)Dnmt1和Dnmt3a的離體共敲除。結(jié)合免疫熒光，western blot以及RT-PCR技術(shù)，觀察了Dnmt1和Dnmt3a基因共敲除對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元及其分支網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的影響。我們發(fā)現(xiàn):
　　1.CA1腦區(qū)內(nèi)Dnmt3a和 Dnmt1基因共敲除(～50％)對動物的焦慮狀態(tài)無明顯影響。
　　2.CA1腦區(qū)內(nèi)Dnmt3a和Dnmt1基因共敲除(～50％)抑制小鼠的物體識別記憶(novel object preference

4、)。
　　3.CA1腦區(qū)內(nèi)Dnmt3a和Dnmt1基因共敲除(～50％)抑制小鼠的社交識別記憶(social novelty preference)。
　　4.CA1腦區(qū)內(nèi)Dnmt3a和 Dnmt1基因共敲除(～50％)對小鼠空間記憶(spatialmemory)以及場景恐懼記憶（contextual fear memory）無明顯影響。
　　5.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中Dnmt3a和Dnmt1基因共敲除影響了神經(jīng)元的后期

5、發(fā)育，表現(xiàn)為神經(jīng)元分支網(wǎng)絡(luò)單薄，胞體變小。單純敲除Dnmta或Dnmt1基因無此影響。病毒轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)1-2周后，神經(jīng)元數(shù)目無明顯變化，提示Dnmt3a和 Dnmt1基因共敲除不影響細胞的凋亡。
　　6.原代培養(yǎng)神經(jīng)元中，Dnmt1和Dnmt3a基因共敲除影響Ⅲβ-tubulin，actin等結(jié)構(gòu)蛋白的表達，同時突觸囊泡結(jié)合蛋白synapsinⅠ的表達也明顯減少。單純敲除Dnmt3a或Dnmt1基因?qū)σ陨系鞍椎谋磉_水平無影響。

6、>　　7.原代培養(yǎng)神經(jīng)元中，Dnmt1和Dnmt3a基因共敲除影響神經(jīng)元中Akt，GSK3，ERK1/2，rpS6等多種信號通路蛋白的表達。單純敲除Dnmt3a或Dnmt1基因?qū)σ陨系鞍椎谋磉_無影響。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，病毒介導(dǎo)的CA1區(qū)成熟神經(jīng)元內(nèi)Dnmt1和Dnmt3a雙敲小鼠表現(xiàn)出海馬依賴的識別記憶障礙。Dnmt1和Dnmt3a基因雙敲影響原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的后期發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形態(tài)。這些研究再次表明Dnmt1和Dnmt

7、3a介導(dǎo)的DNA甲基化修飾在突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶中起著重要的調(diào)節(jié)作用，兩種酶的功能可能是互相重疊的，即一種酶的缺失可由另一種酶來代償，共同維持正常的DNA甲基化水平。我們推測，Dnmt1和Dnmt3a基因雙敲通過改變表觀遺傳修飾影響了神經(jīng)元內(nèi)與生長發(fā)育及葡萄糖平衡代謝密切相關(guān)的通路蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達，進而影響神經(jīng)元的發(fā)育和分支網(wǎng)絡(luò)（樹突和軸突）的正常形態(tài)和功能，并最終對突觸的可塑性及記憶過程產(chǎn)生長時程的影響。介導(dǎo)這一過程的具體的分子細