Orexin-A對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電的影響及機(jī)制探討.pdf

1、Orexins(又稱hypocretin)是下丘腦神經(jīng)肽，包括orexin-A和orexin-B。Orexins受體有OX1和OX2兩種亞型，屬于G蛋白耦聯(lián)受體。Orexin-A可與OX1受體及OX2受體結(jié)合且具有相似的親和力，而orexin-B與OX2受體的親和力遠(yuǎn)高于OX1。腦內(nèi)orexin能神經(jīng)元胞體集中分布在下丘腦外側(cè)區(qū)和穹窿周圍區(qū)，發(fā)出上行和下行纖維，參與調(diào)控覺醒和睡眠、能量代謝、攝食、神經(jīng)內(nèi)分泌和運(yùn)動(dòng)等多種功能活動(dòng)。海馬作為

2、腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)的主要組成部分，在學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及神經(jīng)纖維通路的不同，海馬又分為CA1、CA2、CA3和CA4等區(qū)域。形態(tài)學(xué)研究表明，海馬接受下丘腦發(fā)出的orexin能纖維支配，并表達(dá)高水平的orexin受體。其中海馬CA1和CA2區(qū)主要表達(dá)OX1受體，而CA3區(qū)主要表達(dá)OX2受體。早期行為學(xué)研究揭示，側(cè)腦室注射orexin-A調(diào)節(jié)大鼠學(xué)習(xí)和記憶，阻斷海馬CA1區(qū)OX1受體可降低大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶

3、能力。然而，迄今為止，關(guān)于orexin對(duì)海馬不同區(qū)域神經(jīng)元自發(fā)放電的直接效應(yīng)及其受體機(jī)制尚不十分清楚。目的:探討orexin-A對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電頻率及模式的影響及其受體機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)采用多管微電極壓力給藥、在體細(xì)胞外單細(xì)胞放電記錄、免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法。雄性Wistar大鼠麻醉后固定于Narishige腦立體定位儀，根據(jù)腦圖譜于海馬CA1區(qū)（前囟后3.0-3.8 mm，旁開2.0-2.4 mm）行開顱手術(shù)。三管玻璃微電

4、極尖端直徑3-10μm，電阻10-20 MΩ，其中的記錄電極加入含2％滂胺天藍(lán)的0.5 M的乙酸鈉溶液，其余兩管分別加入不同的藥物。記錄的電信號(hào)經(jīng)MEZ-8201放大器放大，由Spike2電生理數(shù)據(jù)分析軟件分析單個(gè)神經(jīng)元自發(fā)放電的頻率和放電間隔的變異系數(shù)(coefficient ofvariation，CV)。采用成對(duì)t檢驗(yàn)分析加藥前后同一神經(jīng)元自發(fā)放電頻率和模式的變化，曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)用于比較兩組間的差異，卡方檢驗(yàn)用于比較不同放電模

5、式與orexin反應(yīng)神經(jīng)元的相關(guān)性。結(jié)果:1.在大鼠海馬CA1區(qū)記錄的23個(gè)神經(jīng)元中，微壓力注射orexin-A(0.01 mM)可使其中15個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率由2.96±0.85 Hz增加至8.45±1.86 Hz(t=4.87，n=15，P＜0.001)。Orexin-A平均增加放電頻率411.78±125.46％，較生理鹽水對(duì)照組（加藥前:2.71±0.86 Hz，生理鹽水:2.55±0.87 Hz; t=0.56，n=8，P

6、=0.591）明顯增強(qiáng)(Z=3.87，P＜0.001)。Orexin-A對(duì)CA1區(qū)神經(jīng)元的CV無明顯影響（加藥前:1.23±0.09，orexin-A:1.36±0.11; t=1.20，n=15，P=0.250）。2.在海馬CA1區(qū)記錄的17個(gè)神經(jīng)元中，單獨(dú)給予特異性O(shè)X1受體阻斷劑SB-334867(0.1μM)可使其中7個(gè)神經(jīng)元的放電頻率由4.02±1.08 Hz降至2.11±0.58 Hz(t=2.68，n=7，P=0.036)

7、，表明內(nèi)源性orexin調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電。而在另外10個(gè)神經(jīng)元，給予特異性O(shè)X2受體阻斷劑TCS-OX2-29(0.1μM)后其放電頻率無明顯改變（加藥前:3.11±0.64 Hz，TCS-OX2-29:3.07±0.71 Hz; t=0.11，n=10，P=0.918）;3.同時(shí)給予orexin-A及SB-334867可完全阻斷orexin-A對(duì)CA1區(qū)神經(jīng)元的興奮效應(yīng)。在9個(gè)CA1區(qū)神經(jīng)元，同時(shí)加藥使其放電頻率由3.1

8、3±0.90 Hz變?yōu)?.08±0.79 Hz(t=0.09，n=9，P=0.928);4.應(yīng)用PLC抑制劑U73122可完全阻斷由orexin-A所致的CA1區(qū)神經(jīng)元的興奮效應(yīng)。在記錄的8個(gè)orexin-A敏感神經(jīng)元，加入U(xiǎn)73122后再加入orexin-A可使放電頻率由3.11±0.48 Hz改變至3.33±0.66 Hz(t=0.94，n=8，P=0.376)，表明OX1受體通過PLC通路發(fā)揮其對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的興奮效應(yīng);5.

9、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，電生理實(shí)驗(yàn)記錄大鼠的下丘腦外側(cè)區(qū)表達(dá)orexin-A陽(yáng)性神經(jīng)元，而海馬CA1區(qū)可見清晰的orexin-A陽(yáng)性纖維支配。進(jìn)一步免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)顯示海馬CA1區(qū)表達(dá)OX1受體，且OX1受體既表達(dá)在PV陰性海馬神經(jīng)元也表達(dá)在PV陽(yáng)性的中間神經(jīng)元。結(jié)論:本研究結(jié)果證實(shí)orexin-A通過OX1受體增加大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率。內(nèi)源性orexin通過OX1受體調(diào)控CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電。PLC信號(hào)通路參與激