miR-125b靶向調(diào)控DNMT3b介導(dǎo)p53 DNA甲基化在Hcy致血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用研究.pdf

1、目的：觀察同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)對血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)p53甲基化程度的影響，明確DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNA methyltransferase3b, DNMT3b)是否對p53甲基化有調(diào)控作用；觀察Hcy對血管平滑肌細(xì)胞miR-125b表達(dá)的影響，確定miR-125b是否與DNMT3b之間存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，闡明Hcy通過miR-125b靶

2、向調(diào)節(jié)DNMT3b進(jìn)而調(diào)節(jié)p53甲基化導(dǎo)致VSMCs增殖的機(jī)制。
　　方法：以原代培養(yǎng)的人臍靜脈平滑肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，分為空白對照組、Hcy干預(yù)組(50、100、200、500μM)、葉酸拮抗組(Hcy l00μM+葉酸30μM)總計(jì)6組；巢式降落式甲基化特異性 PCR法(ntMS-PCR)檢測各組細(xì)胞 p53基因啟動子區(qū)DNA甲基化改變；轉(zhuǎn)染DNMT3b RNAi表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入VSMCs，分析p53甲基化變化；生物信息學(xué)分析miR

3、-125b與DNMT3b之間的靶向關(guān)系；qRT-PCR法檢測各組VSMCs中miR-125b的表達(dá)，并構(gòu)建攜載DNMT3b mRNA3’非編碼區(qū)的pGL3重組螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3-DNMT3b)，利用miR-125b的過表達(dá)載體(pEZX-miR-125b)和抑制物(miR-125b inhibitor)，轉(zhuǎn)染VSMCs，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性，并利用qRT-PCR和Western blot測定DNMT3b

4、基因mRNA及蛋白水平；pEZX-miR-125b及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染VSMCs后，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果：1. ntMS-PCR測p53基因啟動子區(qū)DNA甲基化改變，結(jié)果顯示Hcy可以使p53基因發(fā)生高甲基化改變，但并不是劑量依賴關(guān)系，在100μM Hcy處作用最明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；以DNMT3b RNAi表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMCs，下調(diào)DNMT3b的表達(dá)，之后檢測

5、p53啟動子區(qū)甲基化變化，結(jié)果顯示p53甲基化程度下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，在DNMT3b mRNA1000-1006bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)miR-125b的7nt的作用位點(diǎn)；分析其二級結(jié)構(gòu)自由能，結(jié)果為-26.7 kcal/mol。
　　3. qRT-PCR法檢測各組VSMCs中miR-125b的表達(dá)結(jié)果顯示，Hcy干預(yù)各組miR-125b表達(dá)下調(diào)，但并不是劑量依賴關(guān)系，

6、在100μM Hcy處作用最明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；以Hcy拮抗劑葉酸干預(yù)后，miR-125b表達(dá)較100μM組有升高趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.利用miR-125b的過表達(dá)載體(pEZX-miR-125b)和抑制物(miR-125b inhibitor)分別與pGL3-DNMT3b共轉(zhuǎn)染VSMCs，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性，結(jié)果顯示與空質(zhì)粒組相比，pEZX-mi

7、R-125b可以顯著抑制熒光素酶活性(P<0.01)，加入Hcy之后，熒光素酶活性更強(qiáng)(P<0.01)；而miR-125b inhibitor的加入得到與之相反的結(jié)果(P<0.01，P<0.05)。
　　5.利用pEZX-miR-125b和miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染VSMCs，qRT-PCR和Western測定DNMT3b基因mRNA及蛋白水平；結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒對照組相比，pEZX-miR-125b轉(zhuǎn)染組可以明顯下

8、調(diào)DNMT3b基因mRNA及蛋白水平(P<0.01)，加入Hcy之后，這種抑制作用被減弱（表達(dá)上調(diào)）(P<0.05)；而miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染組得到與之相反的結(jié)果(P<0.01，P<0.05)。
　　6. pEZX-miR-125b及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染VSMCs后，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示與對照組相比，pEZX-miR-125b組可以明顯抑制VSMCs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

9、.01)，加入Hcy之后，這種抑制作用被減弱；而在miR-125b inhib itor組卻得到相反的結(jié)果(P<0.01)。
　　結(jié)論：1. Hcy通過上調(diào)DNMT3b導(dǎo)致p53啟動子區(qū)高甲基化，進(jìn)而下調(diào)p53表達(dá)變化，這可能是Hcy導(dǎo)致VSMCs增殖的重要機(jī)制之一。
　　2. Hcy下調(diào)了VSMCs中miR-125b的表達(dá)，而且miR-125b能夠通過靶向調(diào)節(jié)DNMT3b基因的表達(dá)，并可能藉此參與Hcy刺激VSMCs增殖的