MicroRNA-208b調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究背景和目的:心血管疾病(cardiovasculardisease，CVD)仍是終末期腎臟病(end-stagerenaldisease，ESRD)患者的最主要死因。約50％ESRD患者死于心血管疾病。ESRD患者普遍存在血管鈣化，血管鈣化尤其是冠狀動(dòng)脈鈣化是這類(lèi)患者心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，血管鈣化會(huì)使心血管疾病的發(fā)病率和死亡率增加3-4倍。雖然血管鈣化曾經(jīng)被認(rèn)為是鈣、磷代謝失衡所導(dǎo)致的礦物質(zhì)異位的結(jié)果，但現(xiàn)在人們認(rèn)為血管鈣化是一

2、個(gè)與骨重塑相似的過(guò)程。研究證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在血管鈣化過(guò)程中具有重要作用。這些成骨樣平滑肌細(xì)胞中心肌蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈、平滑肌α-肌動(dòng)蛋白等平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的表達(dá)減少，而堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、核結(jié)合因子α1（Cbfα1/Runx2）等骨相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。但到目前為止相關(guān)的機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA(microRNA，miRNA)是Lee等于1993年通過(guò)分析突變體線(xiàn)蟲(chóng)

3、的發(fā)育時(shí)間發(fā)現(xiàn)的。miRNA是長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA。迄今為止，miRBase記錄了超過(guò)160個(gè)物種的20000個(gè)成熟miRNA序列。通過(guò)結(jié)合靶基因的3'-UTR，miRNA抑制特異靶基因的翻譯和（或）促進(jìn)它們轉(zhuǎn)錄的mRNAs的降解，從而負(fù)性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。MiRNAs在新陳代謝、分化、細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。研究表明miRNAs在血管鈣化中的作用在于miRNAs與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換有關(guān)。迄今為止，已經(jīng)報(bào)

4、道了miR-30b、miR-30c、miR-125b等miRNAs通過(guò)調(diào)控VSMCs向成骨樣細(xì)胞分化來(lái)參與血管鈣化的發(fā)生。miR-208家族有兩個(gè)成員即miR-208a和miR-208b。miR-208a由α-心肌肌球蛋白重鏈基因(Myh6)編碼，miR-208b由β-心肌肌球蛋白重鏈基因(Myh7)編碼。目前miR-208b在VSMCs向成骨樣細(xì)胞分化過(guò)程中所起的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)miR-208b在終末期腎病患者橈動(dòng)脈中的表

5、達(dá)水平，在此基礎(chǔ)上行體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究miR-208b在VSMCs向成骨樣細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。
　　 方法:收集37例ESRD患者行動(dòng)靜脈瘺手術(shù)時(shí)的橈動(dòng)脈標(biāo)本及11例腎功能正常的患者行胃大部切除手術(shù)時(shí)的胃左動(dòng)脈作為對(duì)照。茜素紅染色測(cè)定鈣鹽沉積，Northern免疫印跡法檢測(cè)橈動(dòng)脈和胃左動(dòng)脈標(biāo)本中miR-208b的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)大鼠VSMCs，用β-甘油磷酸鈉(β-GP)誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化，分別檢測(cè)成骨樣細(xì)胞分化指標(biāo)堿性磷酸

6、酶(ALP)活性、骨鈣素(OC)和礦化結(jié)節(jié)量的變化，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-208b表達(dá)水平的變化，Western免疫印跡法檢測(cè)Runx2蛋白。用脂質(zhì)體法將miR-208bmimics和miR-NC分別轉(zhuǎn)染至兩組大鼠VSMCs，未轉(zhuǎn)染組作空白對(duì)照，用β-GP誘導(dǎo)鈣化，同樣方法檢測(cè)ALP活性、OC分泌量、礦化結(jié)節(jié)量、Runx2蛋白。
　　 結(jié)果:(1)37例橈動(dòng)脈標(biāo)本中發(fā)生血管鈣化的有20例，發(fā)生率為54％，均發(fā)生于血管

7、中膜，對(duì)照組均無(wú)鈣化發(fā)生。ESRD患者橈動(dòng)脈miR-208b的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。(2)β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的VSMCs在向成骨樣細(xì)胞分化的過(guò)程中，ALP活性、OC、Runx2蛋白表達(dá)水平明顯升高，礦化結(jié)節(jié)量也明顯增多。(3)轉(zhuǎn)染了miR-208bmimics的VSMCs與對(duì)照組相比，miR-208b表達(dá)水平顯著增加，而ALP的活性、OC的分泌量、礦化結(jié)節(jié)量及Runx2蛋白的表達(dá)水平均明顯下降。
　　 結(jié)論:過(guò)表達(dá)的miR-2