低氧誘導Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞分化的機制研究.pdf

1、冠脈血管平滑肌細胞在冠脈血管的發(fā)育及冠心病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。明確冠脈血管平滑肌細胞的起源及其分化機制有助于使其更好地應用于先天性冠脈血管病變的預防以及冠脈血管再生等領域。目前認為胚胎心外膜祖細胞是冠脈血管平滑肌細胞的主要來源之一。上皮-間質轉化（EMT）是不同心外膜祖細胞群從心外膜遷移入胚胎心臟并最終分化為心系細胞的主要機制。多種信號通路可調控心外膜祖細胞經EMT轉化向冠脈血管平滑肌細胞的分化過程。胚胎心外膜祖細胞是一個表達 T

2、bx18、Wt1、Tcf21等多種標記基因的祖細胞池。轉錄因子 Tbx18在哺乳動物胚胎心臟發(fā)育過程中起著重要的作用。基因譜系示蹤技術證實Tbx18+心外膜祖細胞是一群具有向冠脈血管平滑肌細胞等間質細胞分化的祖細胞亞群。胚胎心血管系統(tǒng)的發(fā)育是在低氧微環(huán)境中進行的。低氧誘導因子 HIF-1α是低氧信號的關鍵上游因子，參與調控冠脈血管形成發(fā)育。并且低氧能夠通過HIF-1α調節(jié)腫瘤細胞等的EMT轉化過程。低氧誘導發(fā)育相關基因的表達，并促進冠脈

3、循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育。研究表明敲除HIF-1α會導致冠脈血管畸形、間質細胞死亡、心臟環(huán)化異常等改變。1因此，明確低氧對Tbx18+心外膜細胞向冠脈血管平滑肌細胞分化的作用及相關機制具有重要的臨床意義。
　　基因譜系示蹤技術在胚胎發(fā)育研究領域廣泛應用。本研究通過構建Tbx18：Cre/R26REYFP和 Tbx18：Cre/R26RLacz兩種Tbx18基因譜系示蹤模型，并通過體外低氧干預由該模型示蹤培養(yǎng)的Tbx18+心外膜祖細胞，以及在

4、體構建E14.5天胚胎心外膜低氧模型，探討低氧對Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞誘導分化的作用及其主要調控機制。
　　第一部分:通過譜系示蹤模型培養(yǎng)體外示蹤的Tbx18+心外膜祖細胞
　　目的：探討通過構建Tbx18基因譜系示蹤模型培養(yǎng)Tbx18+心外膜祖細胞的方法，為體外研究Tbx18+心外膜祖細胞的分化機制奠定基礎。
　　方法：雄性Tbx18：Cre小鼠以及Cre報告小鼠分別與C57BL/6雌性小鼠交配

5、，經基因型鑒定并篩選出雜合子后代繁殖。雜合子狀態(tài)的Tbx18：Cre雌性小鼠分別與R26REYFP、R26RLacz雄性小鼠以3:2比例交配，提取胎鼠基因組并通過基因型鑒定篩選出 Tbx18基因譜系示蹤模型。通過 E11.5天 Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz雙雜合示蹤胎鼠心臟建立命運示蹤的Tbx18+心外膜祖細胞體外培養(yǎng)模型。觀察培養(yǎng)細胞的自身特性，并通過熒光顯微鏡及Lacz染色技術觀察Tbx18+心外膜祖細胞特異的 Y

6、FP熒光和 Lacz染色；通過免疫熒光和 qRT-PCR技術檢測Tbx18基因的表達，明確獲取細胞的純度。
　　結果：成功繁殖Tbx18：Cre小鼠及Cre報告小鼠，并建立Tbx18基因命運示蹤模型。通過 Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz示蹤模型培養(yǎng)出體外示蹤的Tbx18+心外膜祖細胞群。其中，通過Tbx18:Cre/R26REYFP示蹤模型培養(yǎng)出的Tbx18+心外膜祖細胞在熒光顯微鏡下表達特異的綠色熒光，而通過 T

7、bx18:Cre/R26RLacz示蹤模型培養(yǎng)出的 Tbx18+心外膜祖細胞Lacz染色呈深藍色。
　　結論：通過基因譜系示蹤技術培養(yǎng)的Tbx18+心外膜祖細胞方法相對簡單、細胞純度高。Tbx18+心外膜祖細胞從心臟表面直接爬出后形成的細胞群形態(tài)和排列均與其在心臟表面近似，有利于Tbx18+心外膜祖細胞分化機制的后續(xù)研究。
　　第二部分:體外低氧誘導Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞的分化
　　目的：探討低氧

8、信號誘導Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞的分化及相關機制
　　方法：通過氯化鈷誘導Tbx18+心外膜祖細胞的低氧反應。分別通過熒光共聚焦和免疫組化觀察低氧干預后 Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz示蹤的Tbx18+心外膜祖細胞的平滑肌細胞標志物α-SMA和Myh11的表達。分別觀察細胞在低氧組、常氧組、低氧HIF-1α阻斷組、對照組培養(yǎng)后，Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞分化的比例的差異。通過免

9、疫熒光和qRT-PCR方法觀察低氧干預及阻斷HIF-1α后Tbx18+心外膜祖細胞EMT轉化相關指標的變化。通過Transwell實驗觀察各組細胞遷移能力的差異。
　　結果：低氧干預誘導了Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞的分化。隨著低氧干預的時間延長，分化比例逐漸升高；而阻斷HIF-1α后，低氧誘導的分化比例明顯下降。低氧干預使Tbx18+心外膜祖細胞的ZO-1表達下降，Snail表達升高；阻斷HIF-1α后，抑制了低

10、氧對ZO-1及Snail表達的影響。低氧干預促進了Tbx18+心外膜祖細胞的遷移能力。
　　結論：低氧干預能誘導Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞的分化。低氧的誘導分化作用主要是通過HIF-1α調控該細胞的EMT過程來實現(xiàn)的。Snail是低氧狀態(tài)下HIF-1α的下游作用因子。
　　第三部分：構建在體心外膜低氧模型并誘導Tbx18+心外膜祖細胞的提前分化
　　目的：在組織水平明確Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血

11、管平滑肌細胞分化的潛能。探討在體誘導心外膜低氧對Tbx18+心外膜祖細胞分化的影響及相關機制。
　　方法：通過Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz命運示蹤模型在體觀察Tbx18+心外膜祖細胞向冠脈血管平滑肌細胞的分化。通過孕鼠持續(xù)吸入低氧（15％O2濃度）的方法構建 E14.5天胎鼠心外膜低氧模型，并用低氧探針觀察心外膜低氧狀態(tài)隨時間的改變。通過熒光共聚焦技術觀察α-SMA、Myh11等血管平滑肌細胞標志物以及snail

12、、sulg等EMT調節(jié)因子在E14.5天胚胎心外膜低氧模型Tbx18+心外膜祖細胞的表達。通過 Lacz染色觀察低氧干預后 Tbx18+心外膜祖細胞及其衍化細胞的遷移改變。
　　結果：免疫熒光顯示血管平滑肌細胞標志物α-SMA和Myh11均在 E16.5和新生小鼠冠脈血管壁與 Tbx18：Cre/ R26REYFP示蹤小鼠的YFP熒光共聚焦。E18.5天Tbx18：Cre/R26RLacZ示蹤小鼠的心臟Lacz染色結果顯示，冠脈血

13、管壁細胞Lacz染色呈陽性。低氧探針及HIF-1α的免疫熒光顯示孕鼠吸入低氧后3小時 E14.5天胎鼠心外膜開始出現(xiàn)低氧。并且隨著孕鼠吸入低氧時間的延長，心外膜持續(xù)性處于低氧微環(huán)境。低氧模型小鼠的部分 Tbx18+心外膜祖細胞表達α-SMA、Myh11和snail。與常氧組比較，低氧干預對Tbx18+心外膜祖細胞及其衍化細胞的分布無明顯影響。
　　結論：譜系示蹤模型表明部分冠脈血管平滑肌細胞來源于Tbx18+心外膜祖細胞。心外膜的