Tbx18+前體心外膜祖細(xì)胞分化為竇房結(jié)起搏細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 Tbx18譜系示蹤模型和敲除模型的建立
　　目的:如何示蹤Tbx18+前體心外膜心臟祖細(xì)胞(proepicardialcardiac progenitor cells，CPCs)在胚胎發(fā)育過(guò)程中的的分化具有一定的難度，因此我們建立了兩種示蹤模型系統(tǒng)Tbx18:Cre/Rosa26EYFP/Lacz，用來(lái)示蹤Tbx18+CPCs在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式。為觀察轉(zhuǎn)錄因子Tbx18基因缺失后竇房結(jié)在胚胎的發(fā)育過(guò)程中是否受到影響，

2、我們采用Tbx18:Cre/Cre基因敲除模型來(lái)動(dòng)態(tài)觀察在竇房結(jié)在發(fā)育的過(guò)程中形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)兩個(gè)方面分別檢測(cè)Tbx18示蹤模型和基因敲除模型是否建立成功。
　　方法:采用性成熟雌性基因型為T(mén)bx18:Cre/-小鼠與雄性?xún)煞N純合子報(bào)告基因型為Rosa26EYFP/Lacz交配得到子代鼠，通過(guò)定性PCR法和X-gal染色法篩選出雙雜合譜系示蹤模型，基因型為T(mén)bx18Cre/Rosa26EYFP/Lacz的

3、小鼠。性成熟基因型均為T(mén)bx18: Cre/-的雌鼠與雄鼠交配得到子代敲除鼠，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)鑒定出Tbx18基因敲除小鼠和野生型小鼠。
　　結(jié)果:通過(guò)PCR法鑒定，共同表達(dá)Cre和報(bào)告基因Rosa26EYFP為雙雜合示蹤小鼠，在X-gal染色法中，腳趾被染成藍(lán)色的對(duì)應(yīng)標(biāo)本為T(mén)bx18Cre/Rosa26Lacz雙雜合模型。且示蹤模型和基因敲除模型小鼠基本上符合孟德?tīng)栠z傳定律，無(wú)遺傳遺漏現(xiàn)象和報(bào)告基因的突變情況。兩種

4、譜系示蹤模型可有效示蹤Tbx18+CPCs及衍生的細(xì)胞表達(dá)模式。在基因敲除模型中，觀察出Tbx18敲除鼠在胚胎后期或者出生后24小時(shí)內(nèi)有致死性，與cre基因拷貝數(shù)鑒定結(jié)果一致。
　　結(jié)論:兩種譜系示蹤模型Tbx18:Cre/Rosa26EYFP/Lacz和基因敲除模型Tbx18:Cre/Cre建立成功。其中示蹤模型可示蹤通過(guò)檢測(cè)Cre重組酶的表達(dá)特異性的示蹤Tbx18+CPCs及衍生細(xì)胞的表達(dá)，即反應(yīng)了Tbx18+CPCs的分化及

5、衍生細(xì)胞的分化命運(yùn)，敲除模型可觀察小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中Tbx18缺失后竇房結(jié)的發(fā)育情況。
　　第二部分小鼠Tbx18+CPCs分化為HCN4+竇房結(jié)起搏細(xì)胞
　　目的:小鼠Tbx18+CPCs具有多分化的潛能，研究心臟祖細(xì)胞的起源和分化從病醫(yī)學(xué)的角度闡明先天性和獲得性心臟疾病的發(fā)病機(jī)制。竇房結(jié)起搏電流If由超極化激活環(huán)核苷酸-門(mén)控陽(yáng)離子通道(HCN)編碼，其中HCN4+竇房結(jié)起搏細(xì)胞占主要貢獻(xiàn)。心臟祖細(xì)胞分化為竇房結(jié)起搏細(xì)胞的

6、研究機(jī)制尚未清楚，實(shí)驗(yàn)研究小鼠Tbx18+CPCs分化為HCN4+竇房結(jié)起搏細(xì)胞及轉(zhuǎn)錄因子Tbx18在小鼠竇房結(jié)發(fā)育形成中起到的作用。
　　方法:建立了兩種示蹤模型Tbx18:Cre/Rosa26EYFP/Lacz和基因敲除小鼠Tbx18: Cre/Cre模型，該示蹤模型通過(guò)cre重組酶的表達(dá)能有效的示蹤Tbx18+CPCs分化為HCN4+竇房結(jié)心臟起搏細(xì)胞的命運(yùn)。通過(guò)HE染色、免疫熒光技術(shù)及X-gal整體和切片的染色來(lái)追蹤Tbx

7、18+CPCs分化為HCN4+竇房結(jié)起搏細(xì)胞和基因敲除組竇房結(jié)形態(tài)的改變。在功能學(xué)上通過(guò)對(duì)新生野生型或雜合子與基因敲除小鼠心電圖分析，觀察兩組新生小鼠心率的變化。
　　結(jié)果:基因譜系示蹤模型揭示Tbx18+CPCs可分化為HCN4+竇房結(jié)心臟起搏細(xì)胞，主要分化為竇房結(jié)頭部的HCN4+起搏細(xì)胞，分化為竇房結(jié)尾HCN4+起搏細(xì)胞較少?；蚯贸Ｐ完U明Tbx18缺失后，新生小鼠竇房結(jié)頭部HCN4+心臟起搏細(xì)胞減少，頭部形態(tài)缺失，竇房結(jié)尾