從上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化探討Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的機(jī)制的研究.pdf

1、2008年蔡晨冷等人利用Cre-LoxP遺傳示蹤發(fā)系統(tǒng)現(xiàn)，小鼠心外膜組織中存在一種新的心臟祖細(xì)胞-Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞，這種心臟祖細(xì)胞不斷遷移分化為心系細(xì)胞并對(duì)心臟室間隔、心房、心室肌、心瓣膜及冠狀動(dòng)脈的形成具有重要貢獻(xiàn)。因而，Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞有可能成為心臟祖細(xì)胞新的來(lái)源。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，在成年斑馬魚(yú)及小鼠心臟損傷處存在心外膜胚胎基因Tbx18的重新激活并通過(guò)血管生成作用參與了心臟的損傷修復(fù)反應(yīng)，提示Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)

2、胞可能是心臟損傷修復(fù)的潛在的種子細(xì)胞。由此可見(jiàn)，深入、全面的研究胚胎時(shí)期Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞遷移分化為心系細(xì)胞的機(jī)制對(duì)理解成年心臟損傷修復(fù)機(jī)制有重要啟發(fā)意義。
　　上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指在機(jī)體正常發(fā)育過(guò)程中以及目前已知的各種生理、病理?xiàng)l件刺激作用下，上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能均會(huì)發(fā)生向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象:即細(xì)胞從具有緊密連接、極性和缺乏動(dòng)力的上皮細(xì)胞表型

3、轉(zhuǎn)化為細(xì)胞間作用松散、無(wú)極性、活動(dòng)力強(qiáng)和能產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程與胚胎發(fā)育、器官形成、疾病和腫瘤侵襲密切相關(guān)。已有研究表明，雞及小鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中，心外膜祖細(xì)胞經(jīng)歷EMT事件并能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞。存在于小鼠心外膜上皮中的Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞也有可能是通過(guò)EMT事件向心系細(xì)胞分化。
　　本研究首先建立和鑒定Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。為驗(yàn)證上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)

4、化是Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的機(jī)制。我們利用Tbx18:Cre/R26RlacZ和Tbx18:Cre/R26REYFP這兩種Tbx18基因遺傳示蹤小鼠模型驗(yàn)證EMT事件參與了Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化。同時(shí)利用Tbx18基因敲除小鼠模型驗(yàn)證Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。最后利用Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型深入探討EMT主要標(biāo)志物Snaill，Smad，Slug，T

5、wist和E-cadherin作為局部信號(hào)在Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化中的作用。
　　第一部分Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型的建立及鑒定
　　目的:探討建立及鑒定Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型的方法，為后續(xù)研究Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:將引進(jìn)的Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠進(jìn)行繁殖，并用PCR法鑒定其子代基因型。將子代雌雄雜合子小

6、鼠互交，得到的Tbx18基因敲除、雜合子和野生型胚鼠，并用PCR、熒光定量PCR及胚胎大體形態(tài)鑒定出胚鼠基因型。將雜合子小鼠與RosaEYFP和Rosa26RLacz報(bào)告小鼠交配，得到Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz雙轉(zhuǎn)基因胚鼠，心臟行冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
　　結(jié)果:成功繁殖并鑒定了一定數(shù)量的Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠。利用Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠和

7、報(bào)告小鼠成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。PCR、熒光定量PCR及胚胎大體形態(tài)觀察結(jié)論一致性的檢測(cè)出基因敲除胚胎。PCR及免疫熒光檢測(cè)成功鑒定出Tbx18:Cre/Rosa26REYEP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz雙轉(zhuǎn)基因胚鼠。
　　結(jié)論:成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。用于繁殖、基因敲除及基因遺傳示蹤的子代基因型鑒定結(jié)果均符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。PCR技術(shù)鑒定小鼠子代基因

8、型具有廉價(jià)、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
　　第二部分上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的重要機(jī)制
　　目的:探討Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的可能機(jī)制。
　　方法:1）觀察Tbx18:Cre/Rosa26REY FP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz不同發(fā)育階段胚鼠Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞遷移分化過(guò)程。2）通過(guò)Tbx18基因敲除模型觀察Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質(zhì)

9、轉(zhuǎn)化的關(guān)系
　　結(jié)果:1）在E11.5天，Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞覆蓋在心臟表面，E13.5天及E16.5天可見(jiàn)Tbx18陽(yáng)性心外膜上皮細(xì)胞向心外膜下遷移形成間充質(zhì)細(xì)胞，即經(jīng)歷了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。這些間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了左右心室壁、心房，室間隔，冠狀動(dòng)脈血管平滑肌。2）E16.5天基因敲除心臟和野生型相比，四個(gè)腔室、瓣膜及右室壁未見(jiàn)異常，左室游離壁及室間隔室壁發(fā)育中等變薄，竇房結(jié)頭部缺失。與之相對(duì)應(yīng)的是，E16.5天基因敲除心臟心系細(xì)

10、胞標(biāo)志物（除cTnT外）及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin顯著減少。Vimentin顯著減少的部位在室間隔。
　　結(jié)論: Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞經(jīng)歷上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化后向心系細(xì)胞分化，Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化存在密切關(guān)系。因此上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化的重要機(jī)制。
　　第三部分上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物在Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化過(guò)程中的作用
　　目的

11、:上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物Snaill，Smad，Slug，Twist和E-cadherin在Tbx18陽(yáng)性心外膜祖細(xì)胞向心系細(xì)胞分化中的作用。
　　方法:利用免疫熒光、Western blot及熒光定量PCR技術(shù)比較Tbx18基因敲除小鼠和野生小鼠上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物Snaill，Smad，Slug，Twist和E-cadherin的表達(dá)差異;利用激光共聚焦技術(shù)和流式細(xì)胞分選術(shù)觀察Tbx18:Cre/Rosa26REYFP不

12、同時(shí)期胚胎心臟Tbx18譜系細(xì)胞（包括心外膜祖細(xì)胞及其后代細(xì)胞）內(nèi)這些上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。
　　結(jié)果:1）和野生型小鼠相比，Tbx18基因敲除小鼠心臟Snaill，Smad， Slug，Twist在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著下調(diào)，E-cadherin顯著上調(diào)。2）E16.5天心臟Tbx18譜系細(xì)胞和上述上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化主要標(biāo)志物在室間隔，心瓣膜，冠狀動(dòng)脈血管平滑肌部位發(fā)生共聚焦。這些標(biāo)志物和Tbx18基因在E1