巨噬泡沫細(xì)胞源外泌體中microRNA調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, As)是心腦血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。As發(fā)生過(guò)程中，巨噬泡沫細(xì)胞的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs)大量增殖、遷移，是此類(lèi)疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。外泌體(exosomes)是一類(lèi)直徑大約為30~100 nm由活細(xì)胞分泌產(chǎn)生的膜性囊泡，其內(nèi)攜帶多種物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等，exosom

2、es內(nèi)攜帶的功能性分子可被其他細(xì)胞攝取，從而調(diào)控細(xì)胞的基因網(wǎng)絡(luò)，廣泛參與細(xì)胞間交流。microRNA(miRNA)是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小約為23個(gè)核苷酸，進(jìn)化上高度保守。通常與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’Untranslated Region,3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平降解或抑制靶標(biāo)mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控。動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，巨噬泡沫細(xì)胞形成和VSMCs大量增殖及遷移發(fā)揮重要作

3、用，我們探究巨噬泡沫細(xì)胞與 VSMCs之間能否通過(guò)exosomes進(jìn)行交流，從而探究VSMCs增殖遷移新機(jī)制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴差速離心法分離exosomes后，透射電鏡觀察形態(tài)，其直徑介于30~100 nm之間，呈圓形或杯狀囊泡形態(tài)；檢測(cè)exosomes標(biāo)記蛋白CD9，CD63，CD81均呈陽(yáng)性表達(dá)；miRNA表達(dá)譜共篩選出188個(gè)與巨噬泡沫細(xì)胞相關(guān)的miRNAs(上調(diào)或下調(diào)大于2倍)；與巨噬細(xì)胞源 exosomes相

4、比，巨噬泡沫細(xì)胞源 exosomes可明顯抑制VSMCs的增殖。⑵利用慢病毒載體感染人主動(dòng)脈VSMCs，2μg/ml嘌呤霉素篩選后建立陰性對(duì)照(NC)、miR-483過(guò)表達(dá)組(LV-miR-483)和miR-483-3p抑制組(Anti-miR-483-3p)穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系；與NC組VSMCs相比，LV-miR-483中miR-483-3p表達(dá)上調(diào)約48倍，說(shuō)明我們成功構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)VSMCs細(xì)胞系。MTT法和EdU法分析細(xì)胞增殖能力，

5、與 NC組相比， LV-miR-483組 VSMCs增殖能力受到抑制， Anti-miR-483-3p組VSMCs增殖能力明顯增強(qiáng)；增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)蛋白水平呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。細(xì)胞劃痕損傷法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-483-3p可顯著抑制VSMCs的遷移，而Anti-miR-483-3p組VSMCs的遷移能力受到明顯抑制。表明miR-483-3p可抑制VSMCs增殖和遷