Ihh-PTHrP信號通路在應(yīng)力介導髁突軟骨細胞增殖中的作用及機制.pdf

1、目的：對于伴有功能錯頜畸形的兒童或青少年，采用功能矯正器改變其骨骼位置關(guān)系，協(xié)調(diào)上下頜骨的生長，是獲得理想矯正效果的一種重要治療的手段。功能矯形能夠促進或者抑制頜面部骨骼的生長，引導頜面部向美觀協(xié)調(diào)的方向生長，可以降低后期矯正難度或減少正頜外科手術(shù)的必要性。安氏Ⅱ類錯(恰)畸形是臨床上最常見的錯(恰)畸形類型，其發(fā)病率為15％-20％，占正畸患者的49％。Ⅱ類錯(恰)在矢狀向關(guān)系上的主要表現(xiàn)為下頜的后縮，這一類的病人約占骨性Ⅱ類錯(恰)

2、的50％-60％。安氏Ⅱ類錯頜不僅影響患者功能，如咀嚼、發(fā)音、呼吸、通氣功能等，還能影響患者的外觀，影響患者的心理。安氏Ⅱ類錯頜的治療難度大，治療效果受到患者生長發(fā)育的影響，是正畸治療中的難點。在成人階段，治療嚴重的骨性Ⅱ類錯合畸形的手段多為正頜外科，通過牽張成骨或下頜體部截骨前移下頜。正頜外科存在風險大，費用高，患者接受度低等制約條件，如果在患者青春期前或患者發(fā)育早期采用功能矯形促進下頜的生長，使下頜達到正常的生長，協(xié)調(diào)上下頜骨之間的

3、關(guān)系，通過這種治療手段糾正Ⅱ類錯合患者，減少后期治療難度，減少正頜手術(shù)的必要性，因此早期的功能矯正已經(jīng)成為矯正安氏Ⅱ類錯(恰)畸形常采取的方法。功能矯形中下頜前移的過程常受到顳下頜關(guān)節(jié)髁突與關(guān)節(jié)窩的限制，而髁突作為下頜主要的生長中心，能夠在外力下作出適應(yīng)性改建，對于下頜骨的生長起到?jīng)Q定作用。因此髁突的生長改建的研究對于安氏Ⅱ類錯頜的治療具有重要的理論和臨床意義。
　　髁突表面覆蓋的軟骨為纖維性軟骨，屬于繼發(fā)性軟骨，繼發(fā)性軟骨與原發(fā)

4、性軟骨具有許多不同的特點，其中繼發(fā)性軟骨的生長控制因素既包括遺傳因素還受到環(huán)境與功能因素的影響，同時繼發(fā)性軟骨在受到外力的作用下不僅能產(chǎn)生生長方向的改變還會發(fā)生生長量的變化。髁突軟骨作為繼發(fā)性軟骨通過軟骨內(nèi)成骨的形式不斷形成新骨，終生具有生長改建能力，其生長潛力及在受到刺激后的生長能力在很大程度上影響著下頜骨在三維方向上的生長，尤其是在矢狀方向和垂直方向上的生長。髁突軟骨由軟骨細胞與細胞基質(zhì)組成，細胞成分較少，在適當?shù)牧ψ饔孟瞒镣卉浌羌?/p>

5、胞可以活躍，分裂增殖，使髁突發(fā)生適應(yīng)性改建。髁突軟骨的生長發(fā)育改建是一個非常復(fù)雜的過程，研究表明髁突軟骨的生長涉及到多個方面，包括軟骨細胞的增殖、分化、凋亡，胞外基質(zhì)的合成、修復(fù)等過程，研究證明髁突軟骨在生長改建過程中受到多種生長因子的相互協(xié)調(diào)控制，通過對這些生長因子的研究可以探討髁突軟骨的生長改建機理，對臨床起指導作用?，F(xiàn)在的生物力學認為在功能矯形安氏Ⅱ類錯（?。┗芜^程，通過矯正器持續(xù)的對下頜施加前伸力，顳下頜關(guān)節(jié)韌帶對髁突軟骨牽張

6、加力，改變髁突軟骨細胞的受力環(huán)境，進而通過一系列細胞因子的調(diào)節(jié)，促進軟骨區(qū)細胞分化、增生、改建，進而形成新的骨組織，促進下頜升枝在矢狀方向和垂直方向上的生長改變。但具體的生長因子作用途徑，相互作用機理還處于前期探討階段。前期研究表明由定向前肥大軟骨細胞分泌、Hedgehog家族成員之一Ihh是軟骨細胞內(nèi)最為活躍的反應(yīng)性因子。在對于體內(nèi)長骨等研究表明在軟骨分化成骨，細胞增殖過程中軟骨內(nèi)的Ihh表達可增加。Ihh對軟骨細胞的調(diào)控機制主要是通

7、過Ihh-PTHrP信號軸通路起作用的，Ihh通過一系列的信號傳導，促進關(guān)節(jié)軟骨細胞分泌甲狀旁腺樣蛋白(PTHrP)，通過與非定向前肥大軟骨細胞PTHrP受體結(jié)合而延遲其分化并保持其增殖狀態(tài)。在對體內(nèi)四肢關(guān)節(jié)軟骨的研究證實Ihh在軟骨細胞增殖以及軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但在人體終生具有的改建能力的顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的研究卻未見報道，因此明確Ihh在顳下頜髁突軟骨細胞增殖中的調(diào)控機制對于骨性Ⅱ類錯頜畸形的矯正

8、具有重要的理論和臨床意義。本實驗擬在構(gòu)建兔髁突軟骨細胞體外培養(yǎng)力學刺激模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用應(yīng)力加載系統(tǒng)，對髁突軟骨細胞施以周期性張應(yīng)力，研究兔髁突軟骨細胞在不同應(yīng)力刺激時間下Ihh、PTHrP信號的表達及Ihh-PTHrP信號軸通路在髁突軟骨細胞增殖中的作用及機制。
　　方法：選2周齡新西蘭白兔，取其髁突軟骨，機械粉碎后采用兩步酶原消化法進行消化，獲得具有生物活性的髁突軟骨細胞。對髁突軟骨細胞的培養(yǎng)，鑒定，凍存復(fù)蘇。應(yīng)用多通道應(yīng)力加

9、載裝置對分別對兔髁突軟骨細胞加載1h、2h、6h、12h和24h的周期性張應(yīng)力（頻率為6 cycles/min，拉伸變形率為10％），觀察細胞生長變化，構(gòu)建兔髁突軟骨細胞-體外培養(yǎng)力學刺激模型。將細胞分組，分為加力組與對照組，應(yīng)用流式細胞儀及MTT方法檢測周期性張應(yīng)力加力時間不同對各組髁突軟骨細胞增殖變化的影響。采用R-T PCR技術(shù)和Westem blotting分析檢測周期性張應(yīng)力加力時間不同對各組髁突軟骨細胞Ihh，、PTHrP

10、mRNA和蛋白的表達變化。在施加周期性張應(yīng)力的細胞組中加入Ihh特異性抑制劑環(huán)王巴明(Cyclopamine)與未加抑制劑組細胞對比，采用MTT方法檢測周期性張應(yīng)力加力時間不同對各組髁突軟骨細胞增殖變化的影響。采用R-T PCR技術(shù)和Westernblotting分析檢測周期性張應(yīng)力加力時間不同對各組髁突軟骨細胞Ihh，、PTHrPmRNA和蛋白的表達變化。實驗結(jié)果采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。
　　結(jié)果：1、成功體外培

11、養(yǎng)了髁突軟骨細胞，構(gòu)建髁突軟骨細胞-體外培養(yǎng)力學刺激模型。
　　2、在加力組與對照組細胞增殖的結(jié)果分析，MTT法檢測加力組髁突軟骨細胞數(shù)量增加，在6h、12h、24h結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學差異(p＜0.01);流式細胞技術(shù)結(jié)果表明，加力組S期細胞比例高于對照組，在6h結(jié)果有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，在12h、24h有顯著的統(tǒng)計學差異(p＜0.01);細胞增殖指數(shù)加力組高于對照組，在6h結(jié)果有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，在12h、2

12、4h具有顯著統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。
　　3、加力組與對照組Ihh RT-PCR及Weston-Blot結(jié)果分析:加力組細胞受到張應(yīng)力刺激后Ihh RT-PCR檢測結(jié)果隨時間增加而增加，相同時間點結(jié)果均高于對照組，6h檢測結(jié)果具有統(tǒng)計學差異，12h、24h統(tǒng)計結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學差異。
　　4、加力組與對照組PTHrP RT-PCR western blot結(jié)果分析，加力組細胞受到張應(yīng)力刺激后PTHrP RT-PCR檢測結(jié)

13、果隨時間增加而增加，相同時間點結(jié)果均高于對照組，6h檢測結(jié)果具有統(tǒng)計學差異，12h、24h統(tǒng)計結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學差異。
　　5、加入Ihh特異性抑制劑環(huán)王巴明后，施加周期性張應(yīng)力的髁突軟骨細胞增殖活性兩組之間MTT結(jié)果比較，抑制組（加抑制劑組）低于加力組（未加抑制劑組），兩組之間具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　6、加入Ihh特異性抑制劑環(huán)王巴明后，Real Time PCR檢測Ihh mRNA及Westernblott

14、ing檢測Ihh蛋白表達量結(jié)果分析，抑制組（加抑制劑組）在1h、2h時間段低于加力組（未加抑制劑組），在12h、24h實驗結(jié)果高于對照組，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　7、加入Ihh特異性抑制劑環(huán)王巴明后，施加周期性張應(yīng)力，Real Time PCR檢測PTHrP mRNA及Western blotting檢測PTHrP蛋白表達結(jié)果顯示，抑制組（加抑制劑組）結(jié)果低于加力組（未加抑制劑組），24h抑制組（加抑制劑組）與加力組（未加

15、抑制劑組）相比兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　8、對照組與抑制組細胞增殖MTT方法檢測結(jié)果分析，抑制組雖然使用了Ihh特異性抑制劑，但是加力對細胞增殖還是有一定的影響，抑制組細胞增殖高于對照組。在24h時表現(xiàn)有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　9、對照組與抑制組細胞PTHrP RT-PCR及western blot結(jié)果分析，抑制組雖然使用了Ihh特異性抑制劑，但加載應(yīng)力的細胞PTHrP表達仍高于對照組，在24h時表現(xiàn)有明

16、顯的統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：1、周期性張應(yīng)力可以促進髁突軟骨細胞增殖，同時也能夠促進Ihh以及PTHrP的mRNA以及蛋白的表達，呈一致上升趨勢，說明Ihh-PTHrP信號傳導通路參與了應(yīng)力介導的髁突軟骨細胞增殖。
　　2、加入抑制劑阻斷Ihh的作用后髁突軟骨細胞增殖活性下降，提示應(yīng)力作用下髁突軟骨細胞增殖受到Ihh-PTHrP信號傳導通路的調(diào)控;加入抑制劑后，阻斷Ihh的作用后隨細胞增殖活性下降，PTHrP的表達下降，說明

17、Ihh通過一定的信號因子傳導對PTHrP起調(diào)控作用，通過對PTHrP的影響調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖過程;加入抑制劑后，Ihh表達實驗組與加力組之間沒有統(tǒng)計學差異，說明抑制劑對應(yīng)力作用下Ihh的上調(diào)機制沒有影響
　　3、在阻斷Ihh的作用后髁突軟骨細胞的增殖活性下降但仍高于對照組，說明抑制劑不能完全抑制應(yīng)力對細胞增殖的影響，說明應(yīng)力與細胞增殖活動之間存在多種信號途徑。
　　4、 PTHrP的表達在加力加抑制劑組高于未加力組，Ihh抑制