Shh信號通路對髁突肥大軟骨細胞凋亡活性影響的研究.pdf

1、髁突肥大(Condylar hyperplasia，CH)是發(fā)生于青少年的一種具有自限性的單側髁突過度生長性疾病，無性別差異，常導致患者面部偏斜和咬合紊亂，從而影響美觀和咀嚼。髁突肥大的確切發(fā)病機制未明，關于其治療方式目前仍以髁突高位切除術為主。因此，針對髁突肥大病因開展基礎研究，有助于探索新的治療方式，從而在疾病的早期阻斷其發(fā)生，減輕或避免手術帶來的創(chuàng)傷。
　　大量臨床證據(jù)和組織學證據(jù)已證實患側髁突的生長活躍是髁突肥大的主要病因

2、。髁突軟骨是髁突的生長中心，其生長過程包括軟骨細胞的增殖、分化、肥大及凋亡等重要過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常髁突軟骨細胞相比，髁突肥大軟骨細胞的增殖能力顯著升高。但是關于髁突肥大軟骨細胞的凋亡活性變化對髁突肥大病理進程的影響目前尚未見相關報道。
　　經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，在正常軟骨的生長發(fā)育過程中，Shh信號通路發(fā)揮著至關重要的作用。Shh信號通路的主要成分包括配體Shh，膜受體Ptc和Smo以及轉錄因子Gli等。Tavella

3、S等研究發(fā)現(xiàn)，過表達的Shh信號通路能夠抑制小鼠肢體關節(jié)軟骨的凋亡。而且Shh信號能夠通過介導PI3K/AKT或ERK進而來調控細胞的凋亡。但是Shh信號通路對髁突肥大軟骨細胞凋亡活性的影響尚未明晰，因此，本研究擬探究Shh信號通路在髁突肥大軟骨中的表達情況，并驗證Shh信號通路對髁突肥大軟骨細胞凋亡活性的影響以及潛在的分子機制。
　　實驗一、軟骨組織標本的收集和軟骨細胞的分離培養(yǎng)
　　方法：
　　1，標本來源：正常髁

4、突軟骨標本來至于第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院髁突骨折手術患者（骨折塊無法固定），髁突肥大軟骨標本源于武漢大學口腔醫(yī)院SPECT陽性的髁突肥大手術患者；
　　2，組織標本的處理：選取結構完整的正常髁突軟骨標本及髁突肥大軟骨標本各3例，常規(guī)多聚甲醛固定，EDTA脫鈣；
　　3，軟骨細胞的分離培養(yǎng)：利用酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細胞；收集第二代軟骨細胞，轉藻酸鹽微珠三維培養(yǎng)，以防止軟骨細胞的去分化。
　　結果：在平板培養(yǎng)狀態(tài)下，軟骨細胞形

5、態(tài)多為多角形、三角形，少數(shù)呈圓形或短梭形，細胞集聚生長成簇，呈“鋪路石”樣外觀。藻酸鹽三維培養(yǎng)狀態(tài)下微珠呈水滴狀或圓形，軟骨細胞呈圓球形亮點狀散在分布。
　　結論：利用機械和酶聯(lián)合消化法能夠獲得細胞活性較高的髁突軟骨細胞。
　　實驗二、Shh信號通路在髁突肥大軟骨細胞的表達變化情況
　　方法：
　　1，選取正常髁突軟骨及髁突肥大軟骨組織標本各3例，利用免疫組化染色檢測Shh及其膜受體Smo在兩組軟骨中的表達情況；

6、
　　2，在三維培養(yǎng)的第21天分別收集正常軟骨細胞及髁突肥大軟骨細胞，提取總蛋白及RNA，然后利用Western blotting及Real-time PCR分別從蛋白及基因水平檢測Shh及Smo在兩組軟骨細胞中的表達情況。
　　結果：免疫組化染色結果顯示，髁突肥大軟骨中Shh和Smo均呈異常高表達，且主要集中于未分化間充質層和肥大層。與正常髁突軟骨細胞相比，髁突肥大軟骨細胞中Shh和Smo蛋白和基因的表達水平均顯著增高（P

7、＜0.05）。
　　結論：Shh信號通路在髁突肥大軟骨中呈異常高表達。
　　實驗三、Shh信號通路對髁突肥大軟骨細胞凋亡活性的影響
　　方法：將軟骨細胞隨機分為三組：正常髁突軟骨細胞組（NC組）、髁突肥大軟骨細胞組（CH組）及Cyclopamine（Smo受體阻斷劑）刺激肥大軟骨細胞組（CH+Cyclo組），在三維培養(yǎng)的第5、12、19天分別向CH+Cyclo組添加Cyclopamine刺激48h，分別提取總蛋白及RN

8、A，然后利用Western blotting和Real-time PCR檢測Cleaved-caspase3在三組細胞中的表達情況。
　　結果：與NC組相比，CH組中Cleaved-caspase3基因及蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05），添加Cyclopamine阻斷Shh信號通路之后，Cleaved-caspase3基因及蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。
　　結論：Shh信號通路能夠抑制髁突肥大軟骨細胞的

9、凋亡。
　　實驗四、Shh信號通路對軟骨細胞凋亡活性影響的機制研究
　　方法：將軟骨細胞隨機分為4組：CH組、CH+Cyclo組、LY294002刺激髁突肥大軟骨細胞組（CH+LY294002組）及U0126刺激髁突肥大軟骨細胞組（CH+U0126組）。在三維培養(yǎng)的第5、12、19天分別用Cyclopamine、LY294002（PI3K/AKT阻斷劑）及U0126（MAPK/ERK阻斷劑）刺激細胞48h，于第21天分別提取

10、總蛋白和RNA，然后利用Western blotting檢測Cleaved-caspase3、AKT、ERK、P-AKT及P-ERK的表達變化情況，并用Real-time PCR檢測Cleaved-caspase3 mRNA的表達情況。
　　實驗結果：與CH組相比，CH+Cyclo組中AKT及ERK均無明顯變化（P＞0.05），但其磷酸化狀態(tài)P-AKT及P-ERK的表達卻顯著降低（P＜0.05）。與CH組相比，CH+LY29400