β-catenin對(duì)大鼠髖脫位關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景和目的]：
　　發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位(Developmental dislocation of the hip，DDH)是小兒矯形外科最常見(jiàn)的疾病之一，由于早期篩查工作的開(kāi)展，大部分患兒能獲得及時(shí)的治療，但仍有部分患兒在治療過(guò)程中出現(xiàn)再脫位、殘余髖發(fā)育不良(Residual acetabularDysplasia RAD)，以致成年后早期出現(xiàn)退行性骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)，最終進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換（Total

2、hip arthroplasty，THA），降低了他們的生活質(zhì)量。骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)質(zhì)是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變，一般主要包括兩方面，一方面細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解代謝失衡;另一方面軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)生變化。目前對(duì)于DDH早期發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退行性變的細(xì)胞和分子機(jī)制仍不清楚。近來(lái)有研究表明β-catenin介導(dǎo)的Wnt通路在關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育、增殖、分化、凋亡以及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著關(guān)鍵作用。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)β-catenin對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起著

3、雙向調(diào)節(jié)的作用，主要表現(xiàn)對(duì)于正常軟骨在早期關(guān)節(jié)發(fā)育階段，β-catenin主要是激活促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨分化成熟，軟骨發(fā)育成熟后β-catenin表達(dá)迅速降低;但在髖脫位關(guān)節(jié)軟骨中隨著發(fā)育成熟β-catenin的表達(dá)繼續(xù)升高，促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變，推測(cè)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變可能與β-catenin激活后導(dǎo)致X型膠原(Col X)以及基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase MMPs）的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。正常情況下，軟骨細(xì)胞

4、是軟骨組織內(nèi)唯一的細(xì)胞類型，它在軟骨基質(zhì)損傷及重塑過(guò)程中對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用，但在關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程中β-catenin對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡的調(diào)控尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本文擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬髖脫位的自然進(jìn)程，探討關(guān)節(jié)軟骨在退變過(guò)程中β-catenin對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，為進(jìn)一步深入研究DDH發(fā)生退變的分子機(jī)制提供新思路。
　　[方法]：
　　1.60只新生Wistar大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(n=30)和對(duì)

5、照組(n=30)，雌雄不限，體重均等。并按鼠齡分為2周齡組(n=10)、4周齡組(n=10)、8周齡組(n=10)，對(duì)照組按照類似方法進(jìn)行分組。實(shí)驗(yàn)組大鼠模擬襁褓體位采用醫(yī)用膠帶對(duì)雙髖雙膝伸直并攏固定10天制作髖脫位動(dòng)物模型，然后去除外固定后繼續(xù)飼養(yǎng)。每組達(dá)到預(yù)期時(shí)間進(jìn)行取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中一側(cè)髖關(guān)節(jié)經(jīng)過(guò)固定、脫鈣從冠狀面剖開(kāi)拍照存檔用于測(cè)量臼深指數(shù)以及股骨頭形態(tài)指數(shù)，然后制成切片進(jìn)行番紅O-固綠染色和β-catenin免疫組化染色，高倍

6、鏡下隨機(jī)取五個(gè)不同視野觀察組織形態(tài)變化以及β-catenin在不同時(shí)段關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)，并進(jìn)行Mankin評(píng)分評(píng)估軟骨退變程度。
　　2.另一側(cè)髖關(guān)節(jié)用于提取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，Ⅱ型膠原免疫熒光及甲苯胺藍(lán)染色鑒定，采用CCK-8、流式分析細(xì)胞周期，檢測(cè)兩組在不同時(shí)段的增殖能力與凋亡情況;
　　3.對(duì)8周齡對(duì)照組貼壁軟骨細(xì)胞進(jìn)行LiCl干預(yù)，激活β-catenin表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)β-catenin;重復(fù)CCK-8、流式

7、細(xì)胞分析檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期以及凋亡的改變;TUNEL免疫熒光法檢測(cè)凋亡率。
　　4.所有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t榆驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)果]：
　　1、動(dòng)物模型制作以及大體形態(tài)觀察:
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，2周齡組松脫一只予以剔除，死亡一只。去除外固定后同籠喂養(yǎng)，大鼠體重與身長(zhǎng)與對(duì)照組相比

8、無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)組的大體標(biāo)本均可見(jiàn)股骨頭脫出于髖臼外，證實(shí)建模成功（建模成功率93.3％）;且隨著生長(zhǎng)發(fā)育，股骨頭未能獲得復(fù)位，關(guān)節(jié)囊增厚，髖臼口變小，臼內(nèi)有軟組織嵌入，股骨頭明顯扁平，與髖臼嚴(yán)重不匹配。盡管實(shí)驗(yàn)組臼深指數(shù)以及股骨頭形態(tài)指數(shù)顯示較對(duì)照組發(fā)育小，但隨鼠齡增加仍呈發(fā)育增大趨勢(shì);8周齡時(shí)髖臼發(fā)育基本停止，頭臼不對(duì)稱進(jìn)一步加重(P＜0.05)。
　　2、病理組織形態(tài)觀察以及Mankin評(píng)分:
　　番紅/固綠染色可見(jiàn)到

9、對(duì)照組隨著生長(zhǎng)發(fā)育，關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)呈球形，且軟骨層次清楚，逐漸變薄;實(shí)驗(yàn)組在4周齡關(guān)節(jié)軟骨變形明顯，淺層部分染色變淺，出現(xiàn)軟骨細(xì)胞排列紊亂，局部聚集成簇、纖維化，8周齡時(shí)番紅失染范圍擴(kuò)大，淺層軟骨細(xì)胞消失，殘留陷窩，可見(jiàn)較多裂隙，移行層細(xì)胞明顯增生成簇。Mankin評(píng)分在2周齡時(shí)兩組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，4、8周齡時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P=0.000)，且實(shí)驗(yàn)組成逐漸上升趨勢(shì)。β-catenin:免疫組織化學(xué)中可見(jiàn)β-caten

10、in在對(duì)照組大鼠2周時(shí)表達(dá)較多，4周時(shí)表達(dá)明顯增加，隨鼠齡增長(zhǎng)表達(dá)逐漸下降，8周時(shí)表達(dá)很弱;而在實(shí)驗(yàn)組β-catenin表達(dá)無(wú)下降趨勢(shì)，且隨著生長(zhǎng)發(fā)育持續(xù)高表達(dá)。
　　3、體外細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)以及鑒定:
　　軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:軟骨細(xì)胞培養(yǎng)后Ⅱ型膠原免疫熒光及甲苯胺藍(lán)染色鑒定為軟骨細(xì)胞。
　　4、不同時(shí)段軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的改變
　　增殖速率在2周齡時(shí):實(shí)驗(yàn)組(0.86)比對(duì)照組(0.75)快15.1％;4周齡時(shí):實(shí)

11、驗(yàn)組(1.14)比對(duì)照組(0.92)快24.6％;8周:實(shí)驗(yàn)組(0.78)比對(duì)照組(0.64)快21.8％。
　　增殖指數(shù):2周:對(duì)照組為30.4％，實(shí)驗(yàn)組44.9％，兩者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);4周:對(duì)照組為33.7％，實(shí)驗(yàn)組38.4％，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;8周:對(duì)照組為22.4％，實(shí)驗(yàn)組26.4％，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　凋亡率:2周:對(duì)照組22.1％，實(shí)驗(yàn)組55.1％

12、，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。4周:對(duì)照組0.91％，實(shí)驗(yàn)組1.02％，兩者之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。8閏:對(duì)照組0.75％，實(shí)驗(yàn)組49.1％，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　5、LiCl干預(yù)后軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的改變。
　　LiCl激活β-catenin表達(dá):8周齡正常貼壁軟骨細(xì)胞加入LiCl后免疫熒光可見(jiàn)胞漿以及核內(nèi)β-catenin表達(dá)明顯增高，且以胞核內(nèi)增多為主。
　　干預(yù)后增殖速率(0.

13、58)比干預(yù)前正常軟骨細(xì)胞的增殖速率(0.64)下降了9％;與8周實(shí)驗(yàn)組增殖速率(0.78)相比，明顯下降約25.6％。
　　LiCl干預(yù)后增殖指數(shù)從22.4％下降至18.5％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);并明顯低于8周實(shí)驗(yàn)組26.4％，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);
　　LiCl干預(yù)后凋亡率從0.75％上升至33.1％，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，但是顯著低于8周實(shí)驗(yàn)組(49.1％ P＜0.01)。