自噬對(duì)酸敏感離子通道1a介導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種由多種原因引起的退行性關(guān)節(jié)疾病，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel1a，ASIC1a）被胞外酸通過介導(dǎo)胞外 Ca2+內(nèi)流活化，且 ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡在 RA進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用。本研究主要目的是在體外探究自噬對(duì) ASIC1a介導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響，探討

2、自噬在 RA發(fā)病進(jìn)程中的作用。
　　方法：體外分離、提取及培養(yǎng)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，給于適宜濃度的濃鹽酸刺激，體外建立早期 RA模型。在此基礎(chǔ)上，采用 ASIC1a特異性阻斷劑狼蛛毒素（psalmotoxin1，PcTX1）及 ASIC1a短發(fā)夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）阻斷或沉默 ASIC1a，實(shí)驗(yàn)分為正常組、pH6.0組、PcTX1組、pH6.0+PcTX1組和正常組、pH6.0組、ASIC1a

3、 shRNA組、pH6.0+ASIC1a shRNA組，分別觀察ASIC1a對(duì)自噬和凋亡的影響。采用自噬特異性阻斷劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）及 Beclin1小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）阻斷或沉默自噬，實(shí)驗(yàn)分為正常組、pH6.0組、，3-MA組、pH6.0+3-MA組和正常組、pH6.0組、Beclin1 siRNA組、pH6.0+Beclin1 siRNA組

4、，觀察自噬對(duì)ASIC1a介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體；單丹黃酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）染色觀察自噬囊泡的形成； GFP-mRFP-LC3觀察自噬成熟過程；Western blot技術(shù)分析自噬相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：胞外酸化可明顯上調(diào)

5、自噬蛋白 LC3-II水平，顯著增加胞質(zhì)內(nèi)自噬小體數(shù)量；胞外酸化（pH6.0）3h自噬蛋白 LC3-II、Beclin1，凋亡相關(guān)蛋白剪切性PARP、剪切性 Caspase-3及剪切性 Caspase-9均高表達(dá)，該過程可被 PcTX1及ASIC1a shRNA逆轉(zhuǎn)；3-MA降低 ASIC1a介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并增加 ASIC1a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為 LC3-II、Beclin1蛋白的下調(diào)，剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切

6、性 Caspase-9蛋白的上調(diào)以及細(xì)胞凋亡率的增加；此外，預(yù)處理的 Beclin1 siRNA降低了自噬蛋白LC3-II、Beclin1的表達(dá)，增加了凋亡蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9的表達(dá)以及上調(diào)了細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)論：結(jié)果顯示激活的 ASIC1a可在體外介導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生，阻斷或沉默自噬可以增強(qiáng) ASIC1a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因此在 RA發(fā)病過程中自噬可能被作為一種新