酸敏感離子通道1a在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種難治性多系統(tǒng)疾病，已有研究表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性代謝物聚集導(dǎo)致的關(guān)節(jié)液pH值下降可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡，并最終引起關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)的侵蝕和破壞。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡與一些自身免疫性疾病，例如RA的發(fā)生有關(guān)，提示細(xì)胞焦亡可能參與了RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但是RA發(fā)生過(guò)程中是否存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡目前尚不清楚。

2、酸敏感離子通道（acid-sesing ion channels，ASICs）是一類由細(xì)胞外質(zhì)子激活的陽(yáng)離子通道，主要作用是通透Na+和Ca2+。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a通過(guò)上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i促使RA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，而ASIC1a在RA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步研究證明?；钚匝踝杂苫╮eactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞內(nèi)的一種重要信使分子，具有極為重要的生物學(xué)活性，

3、在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，ROS與細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i密切相關(guān)并參與細(xì)胞焦亡過(guò)程，但是ROS在ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡中的作用目前尚不清楚。本課題通過(guò)體內(nèi)體外兩方面實(shí)驗(yàn)研究佐劑性關(guān)節(jié)炎（Adjuvant arthritis，AA）大鼠是否存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，同時(shí)觀察ASIC1a在此過(guò)程中的作用及其可能機(jī)制。本課題主要包括以下四個(gè)方面：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡過(guò)程，以

4、及ASIC1a在細(xì)胞焦亡過(guò)程中的作用。
　　Sprague–Dawley大鼠40只，隨機(jī)分為正常組、AA模型組、AA模型+陽(yáng)性藥阿司匹林（50mg/kg）組、AA模型+ASIC1a阻斷劑阿米洛利（100mg/kg）組。所有大鼠于造模后第28天處死，收集大鼠血漿、脾臟、膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)。結(jié)果表明，弗氏完全佐劑可誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，阻斷ASIC1a可以顯著抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡。具體表現(xiàn)為：阻斷ASIC1a可以抑制AA大鼠踝

5、關(guān)節(jié)滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨侵蝕和破壞，以及多種炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，并可以抑制AA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨II型膠原（collagen II，Col2a）蛋白在關(guān)節(jié)炎發(fā)生過(guò)程中的降解；阻斷ASIC1a可以抑制AA大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨apoptosis-associated speck-like protein（ASC），Caspase-1，NOD-like receptor protein3（NLRP3），蛋白多糖（aggrecan,Agg），Col2a

6、，ASIC1a，IL-1β，IL-18的表達(dá)，阿司匹林也表現(xiàn)出類似的抑制關(guān)節(jié)炎炎癥和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的效果。
　　以上結(jié)果提示：AA大鼠存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，阻斷ASIC1a可以顯著抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)觀察胞外酸化處理對(duì)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響。
　　原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按照如下分組：（1）pH7.4正常組、 pH7.0酸化組、pH6.5酸化組和 pH6.0酸化組，各組細(xì)胞分別用相應(yīng)p

7、H值的含1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。（2）pH7.4正常組、pH6.0酸化6h組、酸化12h組、酸化24h組和酸化48h組，酸化處理相應(yīng)時(shí)間后收集細(xì)胞和培養(yǎng)基上清液。（3）pH7.4正常組、pH6.0酸化組、pH6.0+Caspase-1特異性抑制劑AC-YVAD-CHO（10μM）處理組，細(xì)胞接受相應(yīng)處理后再用pH6.0的培養(yǎng)基處理24h。結(jié)果表明胞外酸化處理24h和48h可以促進(jìn)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASC, Caspase-1,

8、NLRP3, ASIC1a, IL-1β, IL-18的表達(dá)，同時(shí)胞外酸化處理也可以上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平。此外用AC-YVAD-CHO抑制Caspase-1表達(dá)可以抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的上述蛋白和基因的表達(dá)。
　　以上結(jié)果提示：胞外酸化處理可以顯著誘導(dǎo)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ASIC1a和ROS表達(dá)量。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)觀

9、察阻斷和沉默ASIC1a對(duì)胞外酸化處理誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響。
　　原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按照如下分組：pH7.4正常組、pH6.0酸化組、pH6.0+ASIC1a沉默組、pH6.0+空質(zhì)粒對(duì)照組以及pH6.0+ASIC1a特異性抑制劑Pctx-1(100ng/ml）組，細(xì)胞接受相應(yīng)處理后再用pH6.0的培養(yǎng)基處理24h。結(jié)果表明基因和蛋白上抑制ASIC1a可以顯著抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASC，Ca

10、spase-1，NLRP3，ASIC1a，IL-1β，IL-18的表達(dá)，以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Pctx-1可以顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i和ROS水平。
　　以上結(jié)果提示：阻斷ASIC1a抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，此過(guò)程可能與其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i和ROS水平有關(guān)。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)觀察Ca2+、ROS對(duì)ASIC1a介導(dǎo)的酸化誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響。
　　

11、原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按照如下分組：pH7.4正常組、pH6.0酸化組、pH6.0+Ca2+螯合劑BAPTA-AM（10μM）處理組、pH6.0+ROS還原劑NAC（10mmol/L）處理組，細(xì)胞接受相應(yīng)處理后再用pH6.0的培養(yǎng)基處理24h。結(jié)果表明BAPTA-AM可以顯著抑制胞外酸化誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASC，Caspase-1，NLRP3，ASIC1a，IL-1β，IL-18的表達(dá)，以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平和細(xì)胞內(nèi)RO

12、S水平；ROS還原劑NAC也可以顯著抑制胞外酸化處理誘導(dǎo)的上述蛋白和基因的表達(dá)。
　　以上結(jié)果提示：細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載引起的細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)上調(diào)參與了ASIC1a介導(dǎo)的胞外酸化誘導(dǎo)的原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的焦亡過(guò)程。
　　綜上所述，本研究結(jié)果提示：AA發(fā)生過(guò)程中以及胞外酸化處理通過(guò)激活關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASIC1a，調(diào)節(jié)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)上調(diào)，最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡