酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質細胞炎癥反應中的作用及機制.pdf

1、第一部分:酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質細胞的表達及功能
　　目的:酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是一種配體門控型離子通道,屬于退化蛋白/上皮鈉通道超家族(DEG/ENaC)成員。自1980年在神經元細胞膜上首次被發(fā)現(xiàn)報道后,受到越來越多的關注。神經系統(tǒng)中,ASICs廣泛分布于前腦、中腦、腦干、腦橋、小腦、上丘腦、脊髓等部位,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)在神經元外也有大量的ASICs表

2、達,包括神經膠質細胞和免疫細胞。不同的ASIC亞單位在多種生理病理過程中發(fā)揮著重要作用,包括缺血性腦損傷、疼痛、學習記憶、癲癇、多發(fā)性硬化、偏頭痛、腸應激綜合癥等。已有研究表明,ASICs與免疫炎癥具有密切的關系,但小膠質細胞上是否有ASICs的表達目前尚無報道。本實驗旨在從基因水平和蛋白水平檢測ASICs的表達,并研究該通道在小膠質細胞上的特性。
　　方法:采用RT-PCR的方法在mRNA水平檢測小膠質細胞ASICs的表達;實時

3、定量PCR定量分析ASIC1、2a、3三種亞型在小膠質細胞表達的比例;westernblotting方法在蛋白水平檢測小膠質細胞ASICs的表達;細胞免疫熒光標記的方法確定ASICs三種亞型在小膠質細胞上的分布;全細胞膜片鉗檢測小膠質細胞ASICs電流特性;鈣離子成像的方法檢測小膠質細胞上ASICs通道的離子通透性。
　　結果:(1)從基因和蛋白水平分別證實ASIC1、2a、3三種亞型在小膠質細胞上均有表達,實時定量PCR結果表明

4、,ASIC1表達量最多,ASIC3次之,ASIC2a最少。其中,ASIC1和ASIC3在胞漿和胞核中均有分布,而ASIC2a主要分布在胞核。(2)LPS刺激的小膠質細胞胞外pH值快速降低可誘發(fā)ASIC樣電流,該電流具有pH依賴性,pHB0.5B為6.00±0.04;此外,該電流可被100μM阿米洛利抑制,抑制率為63.15％±6.9%;(3)胞外酸化可引起LPS刺激的小膠質細胞胞內鈣升高,該作用可被100μM阿米洛利和10nMPcTx1

5、抑制,抑制率分別達到了61.7%±4.8%和47.3%±6.2%。
　　結論:小膠質細胞上存在ASICs的表達,其中ASIC1擁有最為豐富的轉錄基因。LPS刺激小膠質細胞,易化胞外快速酸化誘發(fā)的內向電流和胞內鈣升高。
　　第二部分:酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質細胞炎癥反應中的作用及機制
　　目的:炎癥發(fā)生時常常伴有組織的酸化,即病變處pH值低于正常,這種低pH環(huán)境被認為是炎癥反應的標志,感受這種變化就能在炎癥反應中發(fā)

6、揮作用。而機體中確有一種酸敏感離子通道,能夠感受細胞外pH的下降,即被細胞外H+激活,通過對Na+和Ca2+的通透形成內向電流,導致細胞膜去極化,產生興奮性效應。目前已經證實ASICs確實在炎性反應中發(fā)揮重要作用。至于ASICs在小膠質細胞神經炎癥的免疫調節(jié)中的作用還不明確。本實驗旨在研究ASICs在LPS刺激下對小膠質細胞炎癥因子的表達和劃痕遷移中的作用。
　　方法:采用western blotting方法觀察LPS誘導的小膠質

7、細胞iNOS和COX-2的表達,利用ASICs通道非特異性阻斷劑amiloride和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1研究ASICs在其中發(fā)揮的作用;細胞免疫熒光標記的方法觀察劃痕誘導的小膠質細胞的遷移,利用ASICs通道非特異性阻斷劑amiloride和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1研究ASICs在其中發(fā)揮的作用。
　　結果:(1)LPS誘導小膠質細胞ASIC1和ASIC2a蛋白表達增加,且ASIC1膜蛋白表達增加。(2)L