培養(yǎng)大鼠心房肌細胞快速起搏早期調(diào)控離子通道重構(gòu)的信號通路研究.pdf

1、研究背景與目的：心房纖顫(房顫)是最常見的心律失常之一，目前對于房顫的治療還缺乏十分有效的措施，其主要原因是對房顫發(fā)生、持續(xù)以及維持的病理生理機制還不完全清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)心房電重構(gòu)在房顫的發(fā)生、維持以及復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用，而離子通道、特別是L-型鈣通道和鉀通道Kv4.3的表達改變可能是房顫電重構(gòu)的真正分子基礎(chǔ)。目前對于房顫刺激誘導(dǎo)離子通道表達改變的機制還不完全清楚。本研究擬利用快速起搏細胞模型，探討快速起搏早期心房肌細胞離子通道表達

2、改變的調(diào)控機制，為房顫的防治提供新的理論依據(jù)。 研究方法： 1.酶解法分離、培養(yǎng)大鼠心房肌細胞，并通過觀察細胞形態(tài)、透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)以及免疫熒光檢測α-actin的表達等方法鑒定細胞。 2.利用培養(yǎng)的心房肌細胞建立快速電場起搏模型。 3.利用免疫細胞化學(xué)染色、RT-PCR以及Western-blotting等方法檢測快速起搏不同時間后L-型鈣通道α1c和鉀通道Kv4.3的表達變化。 4.利用激

3、光共聚焦顯微鏡檢測不同條件下心房肌細胞游離鈣熒光強度。 5.給予快速起搏24h后，利用免疫細胞化學(xué)和Western-blotting等方法檢測ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、CaM、CaMKⅡ以及p-CREB等的表達。 6.分別給予L-型鈣通道、ERK、p38MAPM、CaM和CaMKⅡ特異性阻斷劑或拮抗劑預(yù)處理后，給予快速電場起搏24h，然后利用RT-PCR以及Western-blotting方

4、法檢測L-型鈣通道α1c和鉀通道Kv4.3的表達變化。 7.構(gòu)建CREBsiRNA表達載體，了解其對CREB基因的沉默作用及其對離子通道重構(gòu)的影響。 研究結(jié)果： 1.成功分離培養(yǎng)了大鼠心房肌細胞，經(jīng)鑒定細胞活力、純度能夠滿足實驗需要。 2.成功構(gòu)建了快速電場起搏的細胞模型，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)細胞活性與起搏前無明顯差異，透射電鏡可觀察到細胞空泡樣改變等。 3.快速起搏6h后L-型鈣通道α1c的mRNA

5、和蛋白表達較起搏前持續(xù)降低，并于24h時達到最低值；而鉀通道Kv4.3mRNA和蛋白的表達在快速起搏12h后降低，并且在其后保持相對穩(wěn)定的水平。 4.快速電場起搏24h后可使細胞內(nèi)游離鈣熒光強度明顯升高，而起搏前給予維拉帕米預(yù)處理可明顯抑制快速起搏誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣熒光強度的升高。 5.快速起搏24后，ERK、p-ERK、p-p38MAPK、CaM和CaMKⅡ表達均升高，p38MAPK的表達無明顯變化。 6.分別給予

6、L-型鈣通道、ERK、p38MAPK、CaM和CaMKⅡ特異性阻斷劑維拉帕米、PD98059、SB203580、W-7、KN-93預(yù)處理后，可以不同程度的抑制快速起搏誘導(dǎo)的離子通道的表達下調(diào)，但除維拉帕米外均不能完全阻斷離子通道的重構(gòu)發(fā)生。 7.構(gòu)建成功的CREBsiRNA表達載體對心房肌細胞CREB的表達有顯著的抑制作用，可用于下一步的研究。轉(zhuǎn)染心房肌細胞后行快速電場起搏，可以有效地抑制快速起搏誘導(dǎo)的L-型鈣通道α1c和鉀通道

7、Kv4.3表達的下調(diào)。 結(jié)論： 1.成功分離培養(yǎng)了高純度的大鼠心房肌細胞，并利用原代培養(yǎng)的心房肌細胞建立快速起搏模型。 2.快速電場起搏培養(yǎng)的心房肌細胞可以誘導(dǎo)L-型鈣通道α1c和鉀通道Kv4.3的表達下調(diào)，提示心房肌細胞發(fā)生了離子通道重構(gòu)。 3.給予維拉帕米、MAPKs特異性阻斷劑預(yù)處理可以不同程度的抑制快速起搏誘導(dǎo)的心房肌細胞L-型鈣通道α1c和鉀通道Kv4.3的表達下調(diào)，提示L-型鈣通道-MAPKs

8、信號通路參與了培養(yǎng)心房肌細胞快速起搏早期離子通道重構(gòu)的調(diào)節(jié)。 4.給予W-7和KN-93預(yù)處理同樣可以部分抑制快速起搏誘導(dǎo)的心房肌細胞L-型鈣通道α1c和鉀通道Kv4.3的表達下調(diào)，提示CaM/CaMKs也是調(diào)控培養(yǎng)心房肌細胞快速起搏早期離子通道重構(gòu)的信號通路之一。 5.構(gòu)建成功的CREBsiRNA表達載體轉(zhuǎn)染心房肌細胞后對CREB表達有顯著的抑制作用，并且可以有效地抑制快速起搏誘導(dǎo)的培養(yǎng)心房肌細胞L-型鈣通道α1c和鉀