運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣離子通道的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，探索運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣離子通道的影響，并結(jié)合免疫組化的方法推測(cè)其可能存在的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。
　　方法：Wister大鼠20只，采自于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)（1502056），體重200－250g，雌雄不限，隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組（不給于運(yùn)動(dòng)干預(yù)）、實(shí)驗(yàn)組：運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激＋藥物干預(yù)（每次運(yùn)動(dòng)前30min皮下注射salubrinal）。實(shí)驗(yàn)組大鼠頭部負(fù)重（5％體重）運(yùn)動(dòng)9天。實(shí)驗(yàn)前3

2、天，為動(dòng)物適應(yīng)性訓(xùn)練期，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組＋藥物干預(yù)組皮下注射用二甲基亞砜做溶劑的Salubrinal（1mg/kg），其余2組給予同等劑量的二甲基亞砜。隨后的9天實(shí)驗(yàn)中，給予大鼠皮下注射Salubrinal（0.5mg/kg），運(yùn)動(dòng)后動(dòng)物休息1天，繼而對(duì)大鼠進(jìn)行急性心肌細(xì)胞分離、膜片鉗記錄L型鈣離子電流和免疫組化進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物水平的分析。
　　大鼠心室肌細(xì)胞的分離：Wister大鼠，腹腔注射普通肝素5000U/Kg，20min后腹

3、腔注射1%戊巴比妥1ml/Kg；待麻醉完成后迅速開胸，取出心臟；置于4℃無鈣臺(tái)式液中沖洗后轉(zhuǎn)入4℃無鈣臺(tái)式液培養(yǎng)皿中，游離主動(dòng)脈根部，插入主動(dòng)脈套管，安置于Langendorff灌流裝置上；以無鈣臺(tái)式液8－10ml/min的灌流速度，灌流5－7min后，改用消化酶液灌流20min，灌流溫度37℃，流速8－10ml/min。將心臟從Langendorff裝置上取下，置于37℃KB液中溫育5－10min；剪去心房和右心室，留取左心室游離壁，

4、將左心室組織剪成2mm×2mm×2mm的碎塊，用粗開口巴氏吸管緩慢吹打5min。用200μm的微孔尼龍膜過濾。濾液于室溫下靜置30min，顯微鏡下觀察到上清液中多為死亡的心肌細(xì)胞或懸浮的細(xì)胞碎片時(shí)去除上清，加入KB液，重復(fù)3次，置于4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　細(xì)胞存活率的測(cè)定：2ml巴氏吸管吸取1ml的細(xì)胞懸浮液，滴于載玻片上，滴入1滴0.2%的臺(tái)盼藍(lán)染色，死亡的心室肌細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。存活的細(xì)胞仍然會(huì)保持透亮，光滑的狀態(tài)。存活率（%）

5、=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)＋死亡的細(xì)胞數(shù)）×100%
　　免疫組化：Westernblot取分離好的心室肌細(xì)胞放入2.5ml離心管中，置于4℃離心機(jī)中12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。充分棄上清液，加入裂解液50μl，4℃裂解30min后加入1:5上樣緩沖液，置于100℃的水浴鍋中煮沸10min。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行上樣開始SDS－PAGE凝膠電泳，完成電泳后將分離好的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)后，分別孵CH

6、OP、phospho－eIF2α和caspase－12一抗置于4℃，10小時(shí)后，PBS洗脫一抗，孵二抗（HRP－conjugatedantirabbitimmunoglobulinGantibod），1小時(shí)后開始ECL發(fā)光，并用G-BOX檢測(cè)結(jié)果。
　　應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄急性分離的大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣離子通道。用巴氏吸管吸取數(shù)滴心肌細(xì)胞的懸液置于倒置顯微鏡的灌流槽中，靜置5min待細(xì)胞貼壁后，利用記錄鈣離子的細(xì)胞外液（鈣外

7、液）灌流（2ml/min）沖掉死亡的心肌細(xì)胞，選取貼壁較好、紋理清晰、邊緣整齊、透亮、靜止不動(dòng)且表面光滑的心肌細(xì)胞做全細(xì)胞膜片鉗記錄，電極為硬質(zhì)玻璃材質(zhì)（武漢微探極生產(chǎn)），經(jīng)過水平拉制儀（SutterP-97USA）四步拉制而成。然后用拋光儀（NarishigeScientificInstrumentLab.,Tokyo,Japan）對(duì)拉制好的微電極進(jìn)行拋光處理。電極充灌鈣離子通道極內(nèi)液。安裝于膜片鉗的夾持器上針筒給予正壓，操縱三維操縱

8、器移動(dòng)電極至電極貼于細(xì)胞表面，釋放正壓并適當(dāng)給以負(fù)壓，使細(xì)胞與電極形成高阻封接（≥1GΩ）。調(diào)節(jié)快速補(bǔ)償，以抵消夾持器和電極管壁的快電容。繼續(xù)給予負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄，調(diào)節(jié)慢電容和串聯(lián)電阻以減少瞬時(shí)充放電時(shí)的電流鉗位誤差。脈沖信號(hào)由patchmaster軟件予以控制，通道信號(hào)由EPC-10（HEKA，Germany）膜片鉗放大器記錄并由patchmaster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。實(shí)驗(yàn)在20－25℃的室溫條件下進(jìn)行，全細(xì)胞形成后穩(wěn)

9、定2min后進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。
　　結(jié)果：1與對(duì)照組（n=4）相比運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組（n=4），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物phospho-eIF2α（1±0.50Vs2.31±0.87，P=0.04）、CCAT/enhancer-bindinghomologousprotein(CHOP)(1±0.30Vs3.13±1.20，P=0.034)和caspase-12表達(dá)均升高(1±0.44Vs2.6±0.84，P=0.014)并且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)運(yùn)

10、動(dòng)應(yīng)激觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制。與對(duì)照組（n=12）相比運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組（n=9）的L型鈣離子通道電流密度峰值明顯減低（-3.80±1.26Vs-2.24±1.11，P=0.009）說明運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可以降低L型鈣離子通道電流。而這種降低可以被選擇性的eIF2α去磷酸化抑制劑salubrinal所阻斷，對(duì)照組（n=12）與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激＋salubrinal組（n=7）的L型鈣離子通道電流密度峰值變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（-3.80±1.26Vs-3.82±1.

11、49，P=0.979），運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組（n=9）與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激＋salubrinal組（n=7）相比L型鈣離子通道電流密度峰值明顯減低（-2.24±1.11Vs-3.82±1.49，P=0.03）。而salubrinal通常用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑，這就提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了對(duì)L型鈣離子通道電流的調(diào)節(jié)；2試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組（n=7，points=49），運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組（n=9，points=63）和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激＋salubrinal組（n=12，poin

12、ts=84），運(yùn)動(dòng)應(yīng)激前后半數(shù)激活電壓（-21.06±1.07mVVs-19.39±1.64mVVs-17.69±1.26mV，P=0.96）的改變不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)照組（n=7,points=42），運(yùn)動(dòng)應(yīng)激組（n=8，points=48）和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激＋salubrinal組（n=12，points=72）運(yùn)動(dòng)應(yīng)激前后半數(shù)失活電壓（-29.51±0.18mVVs-27.01±0.40mVVs-27.21±0.44mV，P=0.98）的