溶血磷脂酰膽堿對(duì)心肌細(xì)胞T型鈣離子通道的影響.pdf

1、目的:溶血磷脂酰膽堿(1ysophosphatidylcholine,LPC)是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)的主要活性成分,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。作為一種兩性磷脂,在血漿中的正常濃度范圍是12～166μmol/L。雖然在生理狀態(tài)下心肌細(xì)胞中溶血磷脂酰膽堿的含量較少,但在心肌缺血狀態(tài)下,由于磷脂酶A2的激活[1],可以在心肌細(xì)胞胞內(nèi)和/或細(xì)胞間隙中增加,其作為細(xì)胞膜溶

2、解的毒性產(chǎn)物,具有很強(qiáng)的致心律失常作用。心肌細(xì)胞膜上分布有T型和L型鈣通道的兩種鈣離子通道類型,其中T型鈣離子通道在心臟自律性、心血管的重塑和細(xì)胞的生長(zhǎng)中所發(fā)揮了很大的作用。通過研究溶血磷脂酰膽堿對(duì)心肌細(xì)胞T型鈣通道電流(ICaT)的影響,闡明心肌細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞間隙中溶血磷脂酰膽堿的增加引起心律失常的內(nèi)在信號(hào)調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.制備1-3天新生Wistar大鼠心室肌細(xì)胞。
　　 2.人類心臟T型

3、鈣通道的α1H(Car3.1)和α1G(Car3.2)亞基在}]EK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。
　　 3.大鼠心室肌細(xì)胞的分離。采用Langendorff主動(dòng)脈逆行灌注消化酶溶液方法來進(jìn)行對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞的分離,其基本原理是依靠心臟的搏動(dòng)來排出心臟內(nèi)的積血,避免冠脈血管栓塞或污染,然后再用各種消化酶液進(jìn)行其細(xì)胞分離。通過兩步酶消化方法共得三份不同酶解時(shí)間的細(xì)胞懸液(約50ml/份)。心室心肌細(xì)胞將培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(Sigma),

4、在37℃孵育箱放置備用。
　　 4.使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定新生大鼠心室肌細(xì)胞和異源穩(wěn)定表達(dá)α1G和α1H亞基的HEK-293細(xì)胞(HEK-293/α1G和HEK-293/α1H)中的Cav3.1和Cav3.2T型鈣離子通道,進(jìn)而研究溶血磷脂酰膽堿調(diào)控ICaT的內(nèi)在信號(hào)機(jī)制。
　　 5.玻璃微電極的制作和細(xì)胞封接與全細(xì)胞記錄模式的形成。玻璃微電極經(jīng)玻璃微電極拉制器兩步拉制而成,充以電極內(nèi)液后微電極入水后阻抗為2～6MΩ。

5、應(yīng)選擇紋理清晰、邊緣整齊、表面光滑、兩端棱角分明的心室肌細(xì)胞進(jìn)行封接,封接過程利用三維微操縱器移動(dòng)玻璃微電極,將其移動(dòng)至細(xì)胞的中間位置,輕壓在被選細(xì)胞表面,防止細(xì)胞出現(xiàn)漂移,略施負(fù)壓持續(xù)吸引即可形成1GΩ水平以上的高阻抗封接,對(duì)電極電容補(bǔ)償后再用較大脈沖式負(fù)壓吸破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞記錄形式(whole cell protocol)狀態(tài),并通過調(diào)節(jié)慢電容、快電容補(bǔ)償和電極串聯(lián)電阻補(bǔ)償以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗位誤差。劑量效應(yīng)曲線由下述方程獲

6、得:Fraction=劑量/效應(yīng)比=Imin+(Imax-Imin)/{1+([C]/EC50)h)。其中Imin為最小ICaT值,Imax為溶血磷脂酰膽堿處理后最大ICaT值,[C]為溶血磷脂酰膽堿濃度,EC50為溶血磷脂酰膽堿所致ICaT的半效應(yīng)濃度,h為斜率。
　　 結(jié)果:
　　 1.溶血磷脂酰膽堿顯著提高了新生大鼠心室肌細(xì)胞的自律性和Ica.T。經(jīng)溶血磷脂酰膽堿(10μM)處理后,新生鼠心肌細(xì)胞搏動(dòng)從40±6次/

7、分增至61±7次/分;同時(shí)最大Ica.T增加了20.4％。
　　 2.在異源穩(wěn)定表達(dá)α1G和α1H亞基的HEK293細(xì)胞,溶血磷脂酰膽堿(10μM)對(duì)ICav3.1無顯著影響(37.3±2.5vs39.5±3.1pA/pF,n=26),甚至溶血磷脂酰膽堿濃度增至50μM也沒有明顯增大ICav3.1;但溶血磷脂酰膽堿(10μM)顯著增加了ICav3.2(36.7±2.2VS42.3±3.0pA/pF,n=39),溶血磷脂酰膽堿濃度

8、增至50μM時(shí)最大ICav3.2增為47.5±3.8pA/pF(n=23)。
　　 3. HEK-293/α1H細(xì)胞用蛋白激酶抑制劑預(yù)處理1h后,進(jìn)行全細(xì)胞電壓鉗研究觀察溶血磷脂酰膽堿對(duì)Ica.T的作用。結(jié)果顯示PKA抑制劑(H89,10μM),PKG抑制劑(KT5823,1μM),鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ抑制劑(KN-62,3μM)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2抑制劑(PD98059,10μM)均未顯著影響溶血磷脂酰膽堿對(duì)Ica.Tα1H的增

9、大作用。然而,PKC抑制劑(白屈菜紅堿,5μM)則顯著減弱了溶血磷脂酰膽堿對(duì)I Ca.T(α1H)的作用。這些結(jié)果提示PKC途徑的激活可能介導(dǎo)了溶血磷脂酰膽堿引起的ICav3.2升高。用蛋白激酶PKCa特異性抑制劑(Ro-32-0432;30nM)預(yù)處理后,完全阻斷了溶血磷脂酰膽堿引起的ICav3.2的增加(35.8±1.9vs37.1±2.0pA/pF,n=21)。但在相同培養(yǎng)條件下,PKCβI特異性抑制劑G(o)6976和PKCβⅡ

10、特異性抑制劑CGP-53353并沒有影響溶血磷脂酰膽堿對(duì)ICav3.2的作用(G(o)6976:21.5±3.0pA/pF,n=7:CGP-53353:20.0±2.1 pA/pF,n=8)。溶血磷脂酰膽堿在心肌細(xì)胞胞內(nèi)和胞外的積累可以明顯調(diào)高ICav3.2通道電流,但是對(duì)ICav3.1通道電流調(diào)控并沒有明顯作用。蛋白激酶PKCα特異性抑制劑具有阻斷溶血磷脂酰膽堿對(duì)ICav3.2的作用。
　　 結(jié)論:溶血磷脂酰膽堿通過激活PKC