馬尾松花粉多糖硫酸酯結構解析及對心肌細胞鈣離子通道的調控作用.pdf

1、多糖的分子修飾和結構改造即利用糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團運用化學方法進行修飾，對提高多糖的生物活性具有重要意義。修飾的方法有很多，如硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、雙基團衍生化等。 目前，研究最多的是多糖的硫酸化修飾。多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后，富含SO42-，易與蛋白質的特定結構域結合，由此改變其構象并影響其功能，使其活性增強或改變其原有活性。對于硫酸酯化多糖抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病等研究較多，而對于

2、防治心血管疾病方面卻鮮有報道。 本文以馬尾松花粉（Pinu smassoniana pollen）為原材料，經(jīng)60％乙醇沉淀、Sevag法去蛋白后得到多糖(PPM60)，用氯磺酸-吡啶法進行硫酸酯化修飾，得硫酸酯化多糖(SPPM60)，然后對其進行純化，研究酯化前后及SPPM60純化組分對細胞內游離鈣離子濃度的影響并探討其對細胞鈣離子濃度的調節(jié)機制，以期為鈣離子激動劑的發(fā)展提供理論基礎和新的研究方向。 實驗具體分為四部分

3、。 一、馬尾松花粉多糖的硫酸酯化修飾。 采用氯磺酸-吡啶法對馬尾松花粉多糖進行硫酸酯化改性，得到硫酸酯化多糖。用氯化鋇-明膠比濁法鑒定硫酸根含量，結果表明，硫酸基質量分數(shù)為14.7％，取代度為1.41。紅外光譜顯示已具有硫酸酯鍵（C-O-S和S=O）的特征吸收峰，表明多糖已成功硫酸酯化。 二、馬尾松花粉多糖硫酸酯的純化及理化性質測定。 馬尾松花粉多糖硫酸酯經(jīng)SephacrylS-400HR層析后，最后得到

4、五個組分，按沈脫體積大小依次命名為SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-C、SPPM60-D、SPPM60-E。用不同分子量的葡聚糖作標準品，測得五個組分的分子量大小分別為：1.01×106、6.03×105、1.47×105、3.8×104、1714。HPLC分析其單糖組成發(fā)現(xiàn)SPPM60-A主要由D-葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖組成；SPPM60-B主要由鼠李糖，D-葡萄糖醛酸，葡萄糖，阿拉伯糖組成；SPPM60-C主要由

5、甘露糖，D-葡萄糖醛酸，半乳糖組成；SPPM60-D主要由甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖組成；SPPM60-E主要由甘露糖，鼠李糖，半乳糖，巖藻糖組成，其中SPPM60-D、E均有一未知單糖出現(xiàn)。 三、各組分對大鼠心肌細胞H9C2(2-1)內游離鈣離子濃度的影響。 鈣離子熒光探針Fura2-am對心肌細胞進行負載后，采用雙波長熒光分光光度計檢測其胞內游離鈣離子濃度，發(fā)現(xiàn)PPM60顯著抑制鈣離子濃度，而SPPM60卻能促進鈣離子

6、濃度升高。五個純化組分作用效果各不相同，其中SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-D起正向促進作用，而SPPM60-C、SPPM60-E起負向抑制作用。用細胞膜L型鈣通道特異性阻斷劑維拉帕米作用心肌細胞后檢測，發(fā)現(xiàn)SPPM60-A、SPPM60-B的正向作用均被抑制，說明SPPM60-A、SPPM60-B是通過膜上的L型鈣通道起作用。細胞外液無鈣時，SPPM60、SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-D的正向作用

7、消失，說明其促鈣離子濃度的作用是由胞外鈣離子起始的。 四、各組分對小鼠脾細胞內游離鈣離子濃度的影響。 細胞外液有鈣離子時，SPPM60及其五個純化組分均能提高小鼠脾細胞內鈣離子濃度，但PPM60沒有顯著作用。維拉帕米阻滯膜L型鈣通道后，正向促進作用減弱。當細胞外液無鈣離子時，采用低分子肝素鈉阻滯胞內IP3R，結果SPPM60、SPPM60-A、SPPM60-B的正向作用消失。說明SPPM60及其五個純化組分既能通過L型鈣