松花粉多糖硫酸酯化前后對白血病細(xì)胞的作用研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室體內(nèi)研究曾表明，馬尾松硫酸酯化多糖(SPPM60)能抑制 HepG2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)其惡性，而 PPM60無明顯作用。本次實(shí)驗(yàn)擬以人白血病細(xì)胞株 K562細(xì)胞為研究對象，考察 PPM60或 SPPM60對其生長狀態(tài)的影響并對其機(jī)理進(jìn)行初步探討，以期為馬尾松花粉多糖的開發(fā)利用提供理論支持，并為白血病的防治提供一種潛在的方法。實(shí)驗(yàn)主要分為以下幾個部分:
　　一、PPM60的分離純化及硫酸酯化修飾:采用

2、氯磺酸-吡啶法分別對50mg PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C、PPM60-D進(jìn)行硫酸酯化改性，得到暗黃色產(chǎn)物SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-C、SPPM60-D61.8mg、79.0mg、63.2mg、71.9mg。用氯化鋇-明膠比濁法鑒定其硫酸根含量并計算取代度分別為1.28、1.63、1.31、1.49。
　　二、PPM60硫酸酯化前后對K562細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期的影響:MTT法檢測發(fā)現(xiàn)P

3、PM60對K562細(xì)胞的增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于SPPM60，400μg/mLPPM60或 SPPM60作用K562細(xì)胞48h時抑制率分別約達(dá)到32％和16％。瑞氏染色、Ho。33342/PI熒光雙染觀察 PPM60或 SPPM60對K562細(xì)胞形態(tài)的影響。經(jīng)400μg/mLPPM60作用48h后，細(xì)胞體積縮小，核直徑減小，核染色質(zhì)濃縮，胞質(zhì)豐富，核漿比例降低，細(xì)胞膜完整但不光滑，并出現(xiàn)一定程度的凋亡；SPPM60組與對照組相比沒有明顯差

4、別。流式細(xì)胞技術(shù)檢測PPM60或 SPPM60處理前后 K562細(xì)胞周期分布的變化。PPM60組較對照組G0/G1期細(xì)胞比例顯著性增加，細(xì)胞周期發(fā)生了G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。SPPM60處理組細(xì)胞細(xì)胞周期各個時相以及凋亡率與對照組相比，均沒有顯著性差異。
　　三、PPM60硫酸酯化前后對K562細(xì)胞[Ca2+]i和活性氧的影響:分別以Fura-2/AM和DCFH/DA為探針，熒光分光光度計檢測 PPM60或 SPPM60

5、處理前后[Ca2+]i和胞內(nèi) ROS的變化。PPM60作用24h、48h、72h后，PPM60組[Ca2+]i與對照組相比均明顯上升，SPPM60組[Ca2+]i與對照組各時間點(diǎn)均顯著性降低；PPM60組胞內(nèi) ROS水平明顯升高，SPPM60組胞內(nèi) ROS水平與對照組相比基本沒有變化。黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活力法檢測 PPM60或 SPPM60處理前后胞內(nèi) SOD水平的變化。72h內(nèi) K562細(xì)胞 PPM60作用組的

6、SOD活力較對照組有下降趨勢；而 SPPM60組胞內(nèi) SOD活力與對照組相比，基本沒有變化。TBA法檢測 PPM60或 SPPM60處理前后胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平的變化。12h、24h、48h、72h后，PPM60組細(xì)胞內(nèi) MDA與對照組相比都有所增加，SPPM60組胞內(nèi) MDA水平高于對照組，但幅度甚小。
　　以上結(jié)果表明:(1)PPM60對K562細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，硫酸酯化修飾之后降低了其抑制作用。(2)PPM60抑制