松花粉硫酸酯化多糖對3T3-F442A前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分化的影響.pdf

1、本實驗室前期研究表明，經(jīng)60％乙醇沉淀的硫酸酯化后的松花粉多糖(SPPM60)可以作用于小鼠脾臟混懸淋巴細(xì)胞，并且可以升高脾淋巴細(xì)胞[Ca2+]i；對小鼠淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離后，發(fā)現(xiàn)添加SPPM60同樣可以作用于T、B淋巴細(xì)胞。馬尾松花多糖水提物、醇提物以及甾醇均可作用于3T3-F442A前脂肪細(xì)胞，對脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積累產(chǎn)生促進(jìn)效應(yīng)，并且馬尾松花粉甾醇對脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝以及AMPK和GLUT4的表達(dá)均產(chǎn)生抑制效應(yīng)。目前，鮮有基于馬尾松

2、花粉多糖(PPM60)及酯化物(SPPM60)對3T3-F442A前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分化以及胞內(nèi)鈣離子濃度作用的研究。因此，該研究將重點探究本實驗純化的松花粉多糖(PPM60-B)及其酯化物(SPPM60-B)對3T3-F442A前脂肪細(xì)胞增殖、脂質(zhì)積累和[Ca2+]i等的影響；以及酯化多糖調(diào)控脂肪細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而引起脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累改變的機制。實驗主要分為以下幾部分內(nèi)容：
　　一、實驗采用水煮醇沉法提取工藝提取馬尾松花粉多糖

3、，經(jīng)三氯乙酸法除雜蛋白后，得到經(jīng)多級醇沉和聚丙烯酰胺凝膠Sehpacryl S-400R純化后的60%多糖組分，并命名為PPM60-B,經(jīng)氯磺酸-吡啶法得到酯化多糖SPPM60-B。氯化鋇-明膠比濁法計算多糖取代度并進(jìn)行紅外光譜表征后，驗證多糖酯化成功。兩種多糖可用于進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　二、MTT法分別研究上述兩種多糖在不同濃度和時間下對3T3-F442A前脂肪細(xì)胞增殖的影響。實驗表明，作用前脂肪細(xì)胞24-72 h后，濃度為10μ

4、g/mL、25μg/mL和50μg/mL的SPPM60-B對前脂肪細(xì)胞增殖具有較為顯著的抑制作用。當(dāng)作用時間為48 h，濃度為10μg/mL的SPPM60-B對前脂肪細(xì)胞的抑制作用最強，抑制率可達(dá)到24.92%。而PPM60-B和其他濃度的SPPM60-B在不同作用時間段內(nèi)，均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖的效果。
　　三、將上述兩種多糖在不同濃度下作用于3T3-F442A前脂肪細(xì)胞，通過油紅O染色，鏡下形態(tài)學(xué)觀察前脂肪細(xì)胞分

5、化情況，異丙醇半定量法和甘油三酯試劑盒檢測前脂肪細(xì)胞分化水平。實驗表明，PPM60-B對前脂肪細(xì)胞分化無顯著性影響。而SPPM60-B則出現(xiàn)低濃度抑制分化，高濃度促進(jìn)分化的效果。在濃度為10μg/mL時，SPPM60-B對前脂肪細(xì)胞分化有較為明顯的抑制作用。
　　四、選取處于分化早期的3T3-F442A前脂肪細(xì)胞，雙波長熒光法測定上述兩種多糖引起的分化階段脂肪細(xì)胞[Ca2+]i的變化。實驗證實，PPM60-B對前脂肪細(xì)胞[Ca2+

6、]i變化無顯著性影響。SPPM60-B對前脂肪細(xì)胞[Ca2+]i增加有劑量依賴效果，表現(xiàn)為酯化多糖濃度越高，胞內(nèi)[Ca2+]i越高。200μg/mL SPPM60-B作用效果最強，且作用效果最佳。選取200μg/mL SPPM60-B孵育細(xì)胞，并檢測發(fā)現(xiàn)，各胞內(nèi)鈣離子通道抑制劑(LY294002、U73122、LMWH、2-APB和Verapamil)均能一定程度上抑制由SPPM60-B引起的3T3-F442A前脂肪細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i

7、升高。而低分子肝素(LMWH)和2-APB能完全抑制SPPM60-B所引起的3T3-F442A前脂肪細(xì)胞[Ca2+]i的升高，且抑制后[Ca2+]i低于空白對照組。
　　綜上所述，本實驗結(jié)果表明：松花粉硫酸酯化多糖可以通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度從而對3T3-F442A前脂肪細(xì)胞增殖活性和脂質(zhì)分化和積累產(chǎn)生影響。并且推測，其潛在的分子機制是通過receptor-PI3K-PLC-IP3R-Ca2+信號通路活化胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫IP3R通道，