松花粉多糖的熒光標(biāo)記及其與細(xì)胞TLR4的作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室最近兩年對(duì)松花粉多糖的研究主要集中在脂肪細(xì)胞、癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞等方面。其中針對(duì)免疫細(xì)胞的研究又包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖及鈣離子相關(guān)的信號(hào)通路之間的研究。
　　雖然本實(shí)驗(yàn)室已完成了較多的工作，但是在馬尾松花粉多糖與細(xì)胞的具體的作用是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外仍然不是十分明確。另外，由于松花粉多糖分子無(wú)發(fā)光的基團(tuán)、在細(xì)胞內(nèi)作用復(fù)雜等原因，上述問題的研究比較困難。鑒于這些原因，本次實(shí)驗(yàn)確定將馬尾松花粉多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記后

2、再探討其與細(xì)胞的作用。
　　本文主要包括以下內(nèi)容：
　　一、對(duì)馬尾松花粉粗多糖進(jìn)行提取，本次實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室比較成熟且一直使用的熱水浸提法。然后將去除蛋白的粗多糖用20％、40%、60%、80%濃度的乙醇分級(jí)沉淀。其中，活性較好的60%乙醇沉淀的粗多糖是本此實(shí)驗(yàn)所需多糖，命名為 PPM60。
　　二、對(duì)PPM60進(jìn)行熒光標(biāo)記。第一步，PPM60與酪胺反應(yīng)生成的PPM60-Tyr用凝膠柱 Sephacryl S-400H

3、R進(jìn)行層析，用紫外分光光度計(jì)能夠280nm下測(cè)得較強(qiáng)的吸收峰。第二步，PPM60-Tyr與FITC的反應(yīng)，生成物命名PPM60-Tyr-FITC，生成的PPM60-Tyr-FITC再用Sephacryl S-400HR層析，層析的結(jié)果用紫外分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)測(cè)FITC的吸收峰，用苯酚-硫酸法測(cè)多糖的吸收峰，最后對(duì)比，在前30管內(nèi)有兩個(gè)峰符合要求命名為峰1和峰4。之后再用 Sephacryl S-400HR層析柱分別對(duì)這兩個(gè)峰純化

4、2-3次。純化后的峰1和峰4分別計(jì)算取代度為4.32%和0.66%，都達(dá)到了后期使用流式細(xì)胞儀等機(jī)器檢測(cè)時(shí)對(duì)靈敏度的要求。經(jīng)過檢測(cè)的結(jié)果的分析表明本次熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是成功的。
　　三、研究PPM60-Tyr-FITC對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響。鑒于上述試驗(yàn)中所得的峰1的熒光強(qiáng)度高于峰4，所以選取峰1開展研究。結(jié)果表明PPM60-Tyr-FITC對(duì)細(xì)胞的活性影響不大，滿足作用于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)要求，其中400μg/mL的PPM60-Tyr-FIT

5、C為最適濃度。
　　四、研究PPM60-Tyr-FITC與巨噬細(xì)胞RAW264.7的受體TLR4的作用。使用流式細(xì)胞儀和激光掃描共聚焦顯微鏡等設(shè)備，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC與細(xì)胞作用的情況。結(jié)果表明FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC都能隨著時(shí)間的增加由外而內(nèi)的進(jìn)入細(xì)胞。用抑制劑抑制關(guān)鍵內(nèi)吞相關(guān)蛋白及受體的作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，網(wǎng)格蛋白及TLR4在FITC-dextran和P