心肌細(xì)胞膜表面鈣離子通道在心房顫動(dòng)時(shí)的表達(dá)水平及功能變化.pdf

1、心房顫動(dòng)(Atrial Fibrillation，AF)是臨床上最為常見的心律失常，其主要表現(xiàn)為≥400次/分鐘的不規(guī)則電節(jié)律所引起的心房各部分快速顫動(dòng)，它對(duì)人類健康的影響不容小覷。不論導(dǎo)致何種并發(fā)癥，AF均可顯著增加患者的致殘率和死亡率。它常伴有左心室收縮功能減退和充血性心力衰竭，還可以引起腦血管栓塞。AF可以惡化患者的生活質(zhì)量，并消耗大量的醫(yī)療資源。但由于目前對(duì)于AF的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚，因此目前臨床上對(duì)AF的治療尚缺乏有效手段。

2、
　　鈣離子通道蛋白是一類由多種不同亞型構(gòu)成的離子通道家族，廣泛存在于各種組織中，其作用涉及生長發(fā)育的調(diào)控、自律性的調(diào)節(jié)等多方面。在心肌細(xì)胞表面，目前已證實(shí)存在的鈣離子通道僅有T型及L型，參與了鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，無論是臨床AF患者還是快速心房起搏(Rapid Atrial Pacing)誘發(fā)心房顫動(dòng)的動(dòng)物的心房肌細(xì)胞中，胞漿內(nèi)游離鈣的水平均明顯升高，提示心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣超負(fù)荷(Intracellular Calcium Ov

3、erloading)可能與AF的發(fā)生密切相關(guān)。
　　心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的游離ca2+水平([Ca+]i)取決于兩個(gè)因素：一方面是出胞的Ca2+減少，如SERCA/PMCA系統(tǒng)及Na+-Ca2+/H+-Na+交換系統(tǒng)異常時(shí)，均可導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞膜回?cái)z及外排Ca2+減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平增高；另一方面是入胞Ca2+增加，入胞的Ca2+有兩個(gè)來源，一是肌質(zhì)網(wǎng)表面的鈣離子通道(蘭利堿受體，1，4，5-三磷酸肌醇受體)釋放Ca2+增加，

4、二是細(xì)胞膜表面的鈣離子通道(心肌表面為T型及L型鈣離子通道)介導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+入胞增加。
　　由于心房肌細(xì)胞膜表面的鈣離子通道(T型及L型鈣離子通道)是心房肌細(xì)胞胞漿內(nèi)游離Ca2+的重要來源之一，因此，研究其在AF時(shí)表達(dá)和功能的改變對(duì)于揭示AF時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷形成的機(jī)制及作用有著重要的意義。
　　本研究目的是采用多種技術(shù)手段研究AF時(shí)心房肌細(xì)胞膜表面鈣離子通道的表達(dá)及功能變化，以此闡述細(xì)胞膜鈣離子通道在AF時(shí)心房肌細(xì)胞胞漿

5、內(nèi)鈣超負(fù)荷形成中的作用。標(biāo)本是采自于接受開胸心臟手術(shù)患者的少量心房肌組織，按照基礎(chǔ)疾病類型和心律分組，借助于分子生物學(xué)及免疫組織化學(xué)方法比較了風(fēng)濕性AF組患者、風(fēng)濕性竇性心律患者和正常竇性心律患者之間T型和L型鈣離子通道的表達(dá)水平，并用激光共聚焦顯微鏡鈣成像技術(shù)比較了兩種鈣離子通道不同心律組患者中對(duì)Ca2+通量的影響。
　　第一部分心肌細(xì)胞膜表面鈣離子通道(T型及L型)在心房顫動(dòng)及對(duì)照組心房肌組織中的表達(dá)差異
　　目的：研究

6、正常竇律(NSR)、風(fēng)濕性瓣膜病竇律(RSR)及風(fēng)濕性瓣膜病房顫(RAF)三組患者右房組織中L型鈣離子通道α1C和T型鈣離子通道α1G、α1H亞基mRNA豐度及蛋白定位和表達(dá)差異。
　　方法：術(shù)中獲取各組患者(NSR=10，RSR=11，RAF=16)少量右房標(biāo)本，所有納入患者在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌組織(約200mg～400mg)，于冰生理鹽水中洗凈血跡，分為兩部分，一部分(大小約200mg)剪切為小塊組

7、織后放入無RNA酶的凍存管中，迅速置入液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱保存；剩下組織放入10％中性福爾馬林溶液中固定，留作免疫組化染色用。提取總RNA，設(shè)計(jì)引物，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)各組α1C、α1G及α1H亞基的mRNA豐度相對(duì)定量(2-△△Ct法)；提取總蛋白，蛋白免疫印跡法比較三種α1亞基蛋白表達(dá)水平；HE染色及免疫組織化學(xué)染色比較三組標(biāo)本的差異。
　　結(jié)果：與NSR及RSR組相比，RAF組的α1C及α1H的mR

8、NA豐度及蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)，α1G表達(dá)水平三組間差異不顯著；三種α1亞基在NSR及RSR兩組間表達(dá)水平無顯著差異；HE染色及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)RAF組較另外兩組間質(zhì)增生明顯，核粗大，細(xì)胞膜表面通道蛋白重染，RSR組及NSR組則差異不明顯。
　　結(jié)論：房顫時(shí)，α1C及α1H亞基表達(dá)水平上調(diào)，而α1G亞基表達(dá)水平不變；風(fēng)濕性因素對(duì)L及T型鈣離子通道的表達(dá)并無直接影響，但不能排除其對(duì)鈣離子通道功能發(fā)生影響的可能。
　

9、　第二部分心肌細(xì)胞膜表面鈣離子通道(T型及L型)在心房顫動(dòng)組及對(duì)照組中的功能差異
　　目的：1、在分離人單個(gè)心房肌細(xì)胞的經(jīng)典方法基礎(chǔ)上，探索適合本中心所獲得的心房顫動(dòng)患者心房肌組織的心肌細(xì)胞分離方法；
　　2、在分離獲得的單個(gè)心房肌細(xì)胞基礎(chǔ)上，借助于激光共聚焦熒光倒置顯微鏡及鈣成像技術(shù)，觀察心房顫動(dòng)組及竇率組不同鈣離子通道激活前后胞漿內(nèi)游離Ca2+水平的改變；
　　3、探索成人心房肌活組織切片制備及培養(yǎng)方法，建立一種保

10、留心肌完整結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞電生理研究模型，為下一步電生理研究作準(zhǔn)備。
　　方法：1、改良Bustamante法急性分離成人單個(gè)心房肌細(xì)胞：所有納入患者在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌組織，立即保存于37℃氧飽和的無鈣液中，并在5～10min內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；將標(biāo)本切成細(xì)小的組織塊(<2mm3)，在36～37℃下以氧飽和的無鈣液沖洗3次；將組織塊在含有膠原酶I(0.4m/ml)和蛋白酶XXIV(0.2mg/ml)的無鈣液中

11、孵育20～30min，37℃下持續(xù)充氧，磁力攪拌器4Hz頻率持續(xù)攪拌；用無鈣液沖洗1min；將組織塊在含有膠原酶I(0.4 mg/ml)的無鈣液中孵育，37℃下持續(xù)充氧，磁力攪拌器4Hz頻率持續(xù)攪拌，每10min鏡下觀測(cè)一次，直至出現(xiàn)單個(gè)心肌細(xì)胞；將組織塊放入KB液中輕輕吹打，所獲得的細(xì)胞懸液以200目濾網(wǎng)過濾，KB液保存；取KB液保存30～60min的心肌懸液，吹勻，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，1000 r/min離心5 min，棄上清，按由

12、低到高梯度復(fù)鈣至1.5mmol/L，吹勻后加入培養(yǎng)皿中，于倒置顯微鏡下觀察。加入臺(tái)盼藍(lán)(4g/L臺(tái)盼藍(lán)1份+9份細(xì)胞懸液，放置3min)，血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù)。
　　2、激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察T型及L型鈣離子通道對(duì)Ca2+的通量在房顫組及竇律組的差異：分離獲得AF組及對(duì)照組單個(gè)心房肌細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入Thapsigargin(TG，毒胡蘿卜內(nèi)酯)以耗竭肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的儲(chǔ)備鈣，終濃度1μmol/L，放置10min后

13、，用無鈣液洗凈：將每例標(biāo)本所獲取的存活心肌細(xì)胞懸液分為兩份，滴入激光掃描共聚焦熒光顯微鏡專用培養(yǎng)皿中放置半小時(shí)，讓其自然貼壁。在培養(yǎng)皿中加入熒光染料Fluo-4/AM(終濃度20μmol/L)，孵育30min，用無鈣液洗凈細(xì)胞膜表面染料，然后細(xì)胞外液換用1mmol/L的含鈣液，在其中一份的培養(yǎng)皿中加入L型鈣通道阻斷劑Verapamil(終濃度10μmol/L)，另一份加入T型鈣通道阻斷劑Mibefradil(終濃度1μmol/L)，分別

14、孵育20min；在LSCFM下，用氪氬離子激光激發(fā)(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長516nm)，觀察并記錄鈣離子通道靜息狀態(tài)下人心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強(qiáng)度(OD1)；在培養(yǎng)皿中加入40mmol/L KCl溶液，使細(xì)胞膜除極化，激活未被阻斷的鈣離子通道，記錄鈣離子通道激活后心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強(qiáng)度(OD2)；將所測(cè)得的激活后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度除以靜息狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(OD2/OD1)，所得即為統(tǒng)計(jì)量。組間t檢驗(yàn)比較兩組熒光

15、強(qiáng)度比值。
　　3、探索成人心房肌活組織切片制備及培養(yǎng)方法：所有納入患者在建立體外循環(huán)后、灌注心肌停搏液前切取少量心房肌組織，立即保存于37℃氧飽和的無鈣液中，并在5～10min內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；在標(biāo)本到達(dá)之前，將低熔點(diǎn)瓊脂糖粉在70℃水浴下用超純水溶解成液體(濃度4％)，然后保存于45℃水浴中：標(biāo)本運(yùn)到后用冷無鈣液沖洗干凈血跡；將組織塊放入標(biāo)本固定槽中，將液態(tài)的瓊脂糖溶液倒入槽中，使其沒過組織塊，并立即在標(biāo)本固定槽外周放置冰屑，讓

16、裝置快速冷卻，使瓊脂糖溶液在極短的時(shí)間內(nèi)凝固并將心房肌組織塊包埋其中；小心切除多余瓊脂，保留含有心房肌組織的部分：安裝好自動(dòng)組織振動(dòng)切片機(jī)的工作槽及刀片，在槽外填入冰屑，槽內(nèi)加入無鈣液的冰水混合物；用快速黏合劑將包埋有心房肌組織的瓊脂糖塊固定在物臺(tái)上，放入切片機(jī)內(nèi)切片，切片厚度為150μm～300μm；將獲得的心房肌組織切片4℃下放入含鈣液中梯度復(fù)鈣共計(jì)30min，液體持續(xù)用100％O2飽和；將復(fù)鈣后的心房肌組織切片移入高糖DMEM細(xì)胞

17、培養(yǎng)液中，37℃水浴下孵育30min，持續(xù)用5％CO2+95％O2混合氣體飽和液體；孵育后的心肌組織切片放入紅外倒置相差顯微鏡載物臺(tái)的灌流槽中觀察，灌流槽中為100％O2飽和的含鈣液(1mmol/L)。
　　結(jié)果：1、采用改良的Bustamante兩步酶消化法，可以分離獲得形態(tài)呈桿狀、橫紋清晰、細(xì)胞膜完整的具有典型特征的單個(gè)人心房肌細(xì)胞。復(fù)鈣后，倒置顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞恢復(fù)自主收縮活動(dòng)，完全貼壁后收縮消失，形態(tài)無明顯變化。經(jīng)臺(tái)

18、盼藍(lán)染色后，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染，細(xì)胞存活率約在20％～50％；
　　2、阻滯L型鈣通道后，NSR組細(xì)胞激動(dòng)前后OD比值(OD2/OD1)低于RAF組(1.38±0.20 vs1.88±0.32)，阻滯T型鈣通道后，NSR組細(xì)胞激動(dòng)前后細(xì)胞內(nèi)鈣水平的升高亦低于RAF組(1.43±0.24 vs2.48±0.40)。通過比較各組在阻斷不同鈣離子通道后所得的OD比值發(fā)現(xiàn)，在NSR組中，阻斷兩種鈣離子通道對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影

19、響相當(dāng)，而在RAF組中，阻斷T型鈣通道對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響要大于阻斷L型鈣通道；
　　3、采用本方法制備所得成人心肌活組織切片心態(tài)良好，橫紋清晰，間質(zhì)及閏盤結(jié)構(gòu)清楚，復(fù)鈣后可見自發(fā)性搏動(dòng)。
　　結(jié)論：1、利用改良Bustamante兩步酶消化法能夠成功分離獲得形態(tài)學(xué)良好單個(gè)人心房肌細(xì)胞；
　　2、RAF組對(duì)比NSR組，其T型鈣通道和L型鈣通道的鈣通量均明顯增加，提示其可能參與了心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷的形成；AF發(fā)生后，

20、L型鈣通道鈣通量的增加明顯高于T型鈣通道鈣通量的增加，提示L型鈣通道在AF時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷形成中所起的作用較T型鈣通道更大；
　　3、采用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋及自動(dòng)組織振動(dòng)切片機(jī)切片培養(yǎng)的方法，能夠獲得形態(tài)良好、具有正常機(jī)械活動(dòng)的心肌活組織切片。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.首次研究了T型鈣離子通道的兩個(gè)亞型(α1G、α1H)在風(fēng)濕房顫、風(fēng)濕竇律及正常竇律患者心房組織中的mRNA豐度及蛋白表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)L型鈣離子通道(α1