持續(xù)性心房顫動(dòng)患者心房2型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道變化的研究.pdf

1、1、背景和目的：
　　心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是臨床上最常見(jiàn)的心律失常，見(jiàn)于各種器質(zhì)性心臟病，我國(guó)通常并發(fā)于風(fēng)濕性心臟瓣膜病(rheumatic heart disease，RHD)，特別是二尖瓣病變。部分患者則無(wú)明確病因。AF發(fā)生后可導(dǎo)致心功能進(jìn)一步受損，卒中發(fā)病率上升，病死率成倍增加。
　　AF的預(yù)防和治療均不理想，原因是AF的發(fā)生和維持機(jī)制尚不完全明了。AF發(fā)生后心房組織可發(fā)生一系列的結(jié)

2、構(gòu)和功能改變，致使AF易于復(fù)發(fā)和維持，發(fā)生心房重構(gòu)，其中電生理方面表現(xiàn)為動(dòng)作電位和有效不應(yīng)期時(shí)程的縮短，頻率適應(yīng)性降低，即所謂的電重構(gòu)。電重構(gòu)使得房?jī)?nèi)多子波折返更易于維持，而不易終止。電重構(gòu)牽涉到一系列的離子通道的改變，各種離子通道在電重構(gòu)中所起的作用也成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其中那些心房表達(dá)多于心室的離子通道有可能成為預(yù)防和治療AF的潛在理想靶點(diǎn)。
　　鈣激活鉀通道分布非常廣泛，被細(xì)胞內(nèi)微量鈣離子（＜1.0μM)激活，按電導(dǎo)大小可

3、以分為大電導(dǎo)(big conductance，BK)、中電導(dǎo)(intermediateconductance，IK)和小電導(dǎo)(small conductance，SK)三種類型，SK2則屬于SK的一種亞型，α亞基是通道的功能亞基，為KCNN2基因所編碼;鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)是通道的輔助亞基。SK2可被極低濃度(100 pM～10 nM)的蜂毒明肽(apamin)特異性阻斷。研究證明心房的SK2表達(dá)明顯多于心室，短時(shí)間

4、快速刺激肺靜脈即可見(jiàn)SK2表達(dá)增加，蛋白膜向轉(zhuǎn)移增強(qiáng)，全細(xì)胞水平電流密度加大，并且這些變化與動(dòng)作電位的縮短關(guān)系明顯，因此被認(rèn)為可能是治療AF的另一個(gè)理想靶點(diǎn)。近期的一個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用SK2阻斷劑能夠預(yù)防和終止AF的發(fā)作。但以上研究均為模擬短期AF的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在人類患持續(xù)性AF后SK2的結(jié)構(gòu)和功能的改變尚不為人知曉。
　　本研究主要涉及心房與心室之間、左右心房之間SK2基因與蛋白表達(dá)量的差別。并探討在人類患持續(xù)性AF后SK2各亞

5、基的基因蛋白表達(dá)水平和SK2功能水平的改變，以及這一改變?cè)陔娭貥?gòu)所起的作用，為尋找防治持續(xù)性AF的可能理想靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　2、內(nèi)容和方法：
　　2.1 SK2在心臟各部位的分布特性
　　2.1.1選擇RHD行二尖瓣置換術(shù)的患者，在體外循環(huán)前取左右心耳組織，并分成兩份用于免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymer

6、ase chain reaction，RT-PCR)，檢測(cè)SK2基因和蛋白的表達(dá)水平。
　　2.1.2選擇先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)存在右心室流出道肥厚并行畸形矯正術(shù)的患者，在體外循環(huán)前取右房耳組織，術(shù)中取右室流出道組織，每份標(biāo)本分成兩份用于IHC和RT-PCR，檢測(cè)SK2基因和蛋白的表達(dá)水平。
　　2.1.3應(yīng)用Langendoff灌流裝置急性分離獲得SD大鼠的心房和心室肌細(xì)胞

7、，應(yīng)用全細(xì)胞模式記錄Ca2+激活K+電流(Ik，ca)，也被稱為apamin敏感性K+電流。
　　2.2人患持續(xù)性AF后SK2的改變
　　2.2.1選擇RHD行二尖瓣置換術(shù)的患者，分為是否存在持續(xù)性AF（持續(xù)時(shí)間大于7天）分為AF和竇性心律(normal sinus rhythm，NSR)兩組。在體外循環(huán)前取右心耳組織，進(jìn)行常規(guī)HE染色和Masson染色，觀察細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等一系列心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的變化，并通過(guò)RT-PCR和I

8、HC，檢測(cè)SK2α亞單位和輔助亞單位基因蛋白的表達(dá)水平。
　　2.2.2選擇行二尖瓣置換術(shù)的RHD的患者，分為是否存在持續(xù)性AF分為AF和NSR兩組，在體外循環(huán)前同時(shí)取右心耳組織，兩步酶解法急性分離獲得心房肌細(xì)胞，應(yīng)用全細(xì)胞模式，記錄apamin敏感性K+電流的電流密度。
　　2.2.3應(yīng)用Langendoff心臟灌流系統(tǒng)可以獲得約50％的結(jié)構(gòu)功能良好且耐鈣的心肌細(xì)胞。結(jié)構(gòu)功能良好的心肌細(xì)胞胞膜完整，折光性強(qiáng)，有明顯的橫紋，

9、可用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。
　　3、結(jié)果：
　　3.1 SK2的心臟各部位分布
　　3.1.1左右心房對(duì)照
　　合并持續(xù)性AF的RHD患者8例，SK2通道在左右心房組織的基因與蛋白表達(dá)均未見(jiàn)差別。
　　3.1.2心房心室對(duì)照
　　6例先天性心臟病患者，法洛氏四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)3例，室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)2例，肺動(dòng)脈瓣狹窄(

10、pulmonarystenosis，PS)1例，全部為NSR。KCNN2基因相對(duì)表達(dá)量在人心房和心室間無(wú)差別，但SK2蛋白表達(dá)量心房比心室明顯增加。
　　3.1.3 SD大鼠心房心室肌細(xì)胞Ik，ca電流的比較
　　應(yīng)用數(shù)字相減方法可記錄到大鼠心房和心室肌細(xì)胞的IK，ca。Ik，ca呈內(nèi)向整流特性，對(duì)apamin敏感，翻轉(zhuǎn)電位-60mV，接近Nernst方程。心房心室肌細(xì)胞均可記錄到Ik，ca。脈沖電壓為-50～40mV時(shí)，心

11、房肌細(xì)胞Ik，ca電流密度顯著大于心室肌細(xì)胞;脈沖電壓為-90～-40mV時(shí)，心房心室肌細(xì)胞Ik，ca電流密度無(wú)差別。心房肌細(xì)胞和心室肌細(xì)胞的膜電容測(cè)定值分別為48.25±4.15pF和21.36±3.23pF，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2人類持續(xù)性AF后SK2的改變
　　3.2.1兩組患者基線資料
　　與NSR患者相比，持續(xù)性AF患者二尖瓣狹窄(mitral stenosis，MS)比例更大，左心房?jī)?nèi)徑以及心胸比率

12、增加更顯著，P＜0.05。持續(xù)性AF患者年齡偏大，肺動(dòng)脈收縮壓偏高，但與NSR患者比較，差別未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在男女性別比例、左心室舒張徑、左室收縮徑、心功能NYHA分級(jí)等方面，持續(xù)性AF患者與NSR患者差別不大。
　　3.2.2 HE染色和Masson染色
　　心房肌細(xì)胞縱向呈現(xiàn)條桿狀，橫向呈現(xiàn)類圓形，內(nèi)有肌絲，細(xì)胞核多為一個(gè)，位于細(xì)胞中央，多個(gè)細(xì)胞呈密集束狀排列，有分支相連。持續(xù)性AF患者的心房肌細(xì)胞增大，排列紊亂，持續(xù)

13、性AF患者的心房組織內(nèi)膠原組織增生明顯增加。
　　3.2.3 AF組SK2α亞單位基因和蛋白表達(dá)的變化
　　AF和NSR兩組患者KCNN2基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.70±0.30和1.25±0.52，差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。AF組SK2蛋白表達(dá)減少，IOD分別為2525900±772807.4和2206917±1170312，下調(diào)幅度13％，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），細(xì)胞內(nèi)分布特點(diǎn)變化不明顯。
　

14、　3.2.4 AF組SK2輔助亞單位鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)基因和蛋白表達(dá)的變化
　　持續(xù)性AF發(fā)生后心房組織的CaM mRNA水平無(wú)明顯變化。CaM蛋白的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，主要在心房肌細(xì)胞的胞膜上分布，呈相對(duì)濃然的環(huán)狀;胞漿也有少量分布，表達(dá)主要在核周;胞核內(nèi)無(wú)分布。分布特點(diǎn)與SK2蛋白呈現(xiàn)重疊性。持續(xù)性AF組與NSR組CaM蛋白表達(dá)差別未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2.5持續(xù)性AF患者心房肌細(xì)胞Ik，ca電

15、流的變化
　　AF患者與NSR患者比較心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程顯著縮短。應(yīng)用數(shù)字相減方法可獲得NSR和持續(xù)性AF患者心房肌細(xì)胞的apamin敏感性K+電流，即Ik，ca?？傮w來(lái)講，與NSR患者相比，持續(xù)性AF患者心房肌細(xì)胞均Ik，ca電流密度上調(diào)，在脈沖電壓在-10～+40mV時(shí)，差別達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。持續(xù)性AF患者心房肌細(xì)胞的膜電容顯著增大。
　　4、討論：
　　研究離子通道一般從基因、蛋白以及功能等方面入手，研究方

16、法多種多樣，而較為經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法包括RT-PCR，IHC和膜片鉗3種。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中，正是通過(guò)RT-PCR，IHC和膜片鉗3種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法對(duì)持續(xù)性AF后SK2的變化進(jìn)行研究。為探討SK2在心臟各部位分布的差異性，發(fā)現(xiàn)左右心房間SK2的基因和蛋白表達(dá)均不存在差異，右心耳組織SK2表達(dá)的變化亦可反映左心房的變化。另外還發(fā)現(xiàn)心室組織比較心房組織基因表達(dá)不減少，但蛋白表達(dá)明顯減少，這一結(jié)果和以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，說(shuō)明在人的心室組織中SK2表達(dá)

17、可能存在某種目前尚不明了的翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制。以SD大鼠心房心室肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)心房肌細(xì)胞的Ik，ca的電流密度顯著大于心室肌細(xì)胞，這一結(jié)果提示應(yīng)用SK2通道特異性阻斷劑治療房性心律失常，可以主要影響心房肌細(xì)胞的電生理特性，而對(duì)心室肌細(xì)胞的電生理特性影響很小，因此SK2通道將來(lái)可作為防治房性心律失常的的理想靶點(diǎn)。
　　采集RHD二尖瓣病變患者的右心耳組織，并從基因、蛋白、功能多個(gè)層面應(yīng)用經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法第一次探究人類持續(xù)性AF發(fā)生后

18、SK2通道的變化。本組RHD二尖瓣病變行二尖瓣置換術(shù)(mitral valve replacement，MVR)時(shí)病情均較重，均為持續(xù)性AF，因此未再另列一組，而僅以持續(xù)性AF與NSR患者進(jìn)行比較。與NSR患者相比，持續(xù)性AF組更多為MS患者，左心房增大更明顯。MS患者的心房重構(gòu)的特征既是左心房增大，增大的心房可為多個(gè)折返的存在提供足夠的空間，利于AF的維持。除左心房增大外，HE和Masson染色的病理結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性AF組心房膠原組

19、織增生嚴(yán)重，心肌細(xì)胞排列紊亂。目前認(rèn)為膠原組織增生嚴(yán)重導(dǎo)致心房間質(zhì)纖維化是AF基質(zhì)的重要組成部分，間質(zhì)纖維化可打亂心肌細(xì)胞規(guī)則的排列順序，使細(xì)胞間電信號(hào)傳導(dǎo)減慢，有利于折返的維持。
　　檢測(cè)NSR和AF兩組患者右心耳組織的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)兩組患者心房組織SK2α亞單位基因KCNN2均有表達(dá)，但與既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中短期刺激心房模仿陣發(fā)性AF的結(jié)果不同，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)持續(xù)性AF患者心房組織的KCNN2 mRNA水平下調(diào)。另外，NSR與持續(xù)性

20、AF患者右心房肌細(xì)胞SK2蛋白均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，其蛋白分布主要在細(xì)胞膜。兩組患者心房肌細(xì)胞的SK2分布特點(diǎn)為一致，持續(xù)性AF患者SK2通道蛋白表達(dá)偏低，這與此前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不相同。
　　NSR和持續(xù)性AF兩組患者右心耳組織均有CaM基因表達(dá)，但持續(xù)性AF發(fā)生后右心耳組織的CaM mRNA水平未改變。NSR與持續(xù)性AF患者右心房肌細(xì)胞CaM蛋白均呈現(xiàn)也都呈陽(yáng)性表達(dá)，兩組患者心房肌細(xì)胞的CaM分布特點(diǎn)為一致，蛋白表達(dá)量也未見(jiàn)有變化。

21、以上結(jié)果說(shuō)明，持續(xù)性AF未對(duì)CaM的基因和蛋白表達(dá)造成影響，其表達(dá)水平與持續(xù)性AF apamin敏感性K+電流密度上調(diào)無(wú)關(guān)。
　　應(yīng)用apamin前后電流相減可記錄到單純apamin敏感性電流，持續(xù)性AF患者心房肌細(xì)胞上的apamin敏感性電流密度更大。通道電流的密度可能受很多因素影響，其中一個(gè)重要因素是通道基因蛋白表達(dá)水平，持續(xù)性AF患者KCNN2表達(dá)下調(diào)，一般情況下可以導(dǎo)致apamin敏感性電流密度下調(diào)。但由于AF發(fā)生后，心房

22、肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+顯著超負(fù)荷，胞內(nèi)Ca2+增加可以使SK2功能水平上調(diào)，因此可以認(rèn)為此時(shí)胞內(nèi)Ca2+增加對(duì)于SK2功能水平的影響超過(guò)了SK2基因和蛋白表達(dá)下調(diào)帶來(lái)的影響。
　　5、結(jié)論：
　　綜上所述，右心房SK2基因蛋白表達(dá)的水平可以反映左心房SK2基因蛋白表達(dá)的水平。SK2通道心房心室間基因表達(dá)無(wú)差異，但心房SK2通道蛋白表達(dá)以及apamin敏感性K+電流均較心室增強(qiáng)。與以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不同，人類持續(xù)性AF后，SK2通道α亞