細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化對心房肌小電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流的影響.pdf

1、目的：心房纖顫(Atrial Fibrillation,AF)是最常見的快速性心律失常,隨著年齡的增加其發(fā)病率增加,小于60歲的人群發(fā)病率為0.5％,大于80歲的人群發(fā)病率增加到10％。房顫可使死亡率增加1.5-1.8倍。AF患者可以產(chǎn)生明顯的癥狀,例如喪失活動能力或使活動能力下降,且發(fā)生腦卒中的發(fā)病率增加到15％,心力衰竭的危險(xiǎn)性明顯增加。然而,目前房顫發(fā)生的機(jī)制仍未完全闡明。AF的發(fā)生與動作電位(Action potential,A

2、P)的有效不應(yīng)期(effective refractory period,ERP)縮短密切相關(guān),而動作電位時(shí)程(action potential duration,APD)則由心肌細(xì)胞不同離子通道活動決定。因此,離子通道功能的變化可能與 AF的發(fā)生及維持有關(guān)。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small conductance Ca2+-activated K+channels, SK通道)是鈣激活鉀通道(Ca2+-activated K+chann

3、els, KCa)中的一種,具有電壓不敏感、鈣離子敏感的特性。近幾年研究發(fā)現(xiàn) SK通道存在于心肌細(xì)胞上,且分子生物學(xué)證據(jù)表明在SK通道的4個(gè)亞型(SK1-4)中,SK2通道在人和鼠的心房和心室表達(dá)存在差異,主要表達(dá)在心房。SK2通道為KCa通道,對胞內(nèi)游離鈣離子([Ca2+]i)高度敏感,發(fā)生反應(yīng)迅速,可快速將細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化轉(zhuǎn)換成細(xì)胞膜電位變化。因此推測AF時(shí)胞內(nèi)鈣超載可能影響SK2通道功能,深入討論這些問題對揭示AF發(fā)生的病理

4、生理機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用穿孔膜片鉗技術(shù)(perforated Patch clamp,PPR)記錄全細(xì)胞電流,觀察竇性心律患者(Sinus Rhythm,SR)與AF心律患者心房肌細(xì)胞SK2通道電流變化及其對Ca2+的敏感性的差異,以及觀察L-鈣通道的激動劑Bay-K8644、抑制劑維拉帕米(verapamil)對SK2通道電流的影響,探討AF發(fā)生發(fā)展過程中可能出現(xiàn)的離子通道之間的相互作用,為AF機(jī)制的闡明提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方

5、法：42例接受體外循環(huán)手術(shù)的患者分為兩組:心房顫動組(AF)11例,竇性心律組(SR)31例。心肌細(xì)胞的獲得:取體外循環(huán)術(shù)中切除的右心耳,在氧飽和Cardiplegic液中將組織剪成約1 mm3的小塊,EGTA脫鈣,再進(jìn)行兩步酶消化:酶I(XXIV蛋白酶2-3 U/ml,V膠原酶150 U/ml,BSA1 mg/ml),酶II(V膠原酶150 U/ml, BSA l mg/ml)。選取貼壁良好,折光性強(qiáng),具有較強(qiáng)立體感,表面光滑的心肌細(xì)

6、胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SK2通道電流的記錄:取細(xì)胞置于浴液中,用穿孔膜片鉗技術(shù)記錄全細(xì)胞電流,所得電流通過膜片鉗放大器(CEZ-2300, Nihon konden, Japan)放大,濾波(1 KHz)后輸入計(jì)算機(jī),經(jīng)Clampex10.0軟件采集電流,Clampfit10.1、OriginPro8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖。實(shí)驗(yàn)分組:(1)以人心房肌細(xì)胞為研究對象,用二性霉素 B和/或β-escin作為穿孔電極液,進(jìn)行穿孔膜片鉗實(shí)驗(yàn),并用胞內(nèi)鈣

7、成像系統(tǒng)驗(yàn)證穿孔前后胞內(nèi)鈣變化,以建立鈣離子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的穿孔膜片鉗技術(shù)。(2)在全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下觀察SR組與AF組SK2通道電流的差異。(3)不同的胞內(nèi)鈣離子濃度對AF組與SR組SK2通道電流的影響。(4)全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下觀察L-型鈣通道激動劑Bay-K8644、抑制劑(verapamil)對SK通道電流的影響。結(jié)果：(1)混合使用穿孔電極液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B能形成穩(wěn)定的穿孔膜片

8、鉗記錄模式,且胞內(nèi)鈣測試系統(tǒng)檢測可觀察到穿孔后電極液至細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度增加,F340/F380增強(qiáng)。(2)人心房肌細(xì)胞 SK2通道特性:①在全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下,施以SK2通道電流的刺激方案,可記錄到一個(gè)內(nèi)向整流混合電流,在浴液中加入SK2通道的特異性阻斷劑apamin,加藥前后的內(nèi)向整流綜合電流相減即可獲得 apamin敏感的電流(SK2通道電流)。本實(shí)驗(yàn)記錄到的人心房肌細(xì)胞SK2通道電流具有電壓不敏感、內(nèi)向整流的特性。②在全

9、細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下,100nM apamin可以阻斷部分內(nèi)向整流混合電流,使內(nèi)向整流混合電流減小,用浴液灌流將apamin洗脫后,被阻斷的電流可以恢復(fù)。⑵SR組與AF組SK2通道電流的差異:在全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下,電極液中鈣離子濃度為5×10-7mol/L時(shí),記錄到的AF組的SK2通道電流明顯大于SR組,尤其是在超極化方向。膜電位在-130 mV時(shí),SR組與AF組的SK2通道電流密度分別為:-2.92±0.35pA/pF、-6.83

10、±0.19 pA/pF(nSR=6, nAF=3,p<0.05)。⑶不同濃度的胞內(nèi)游離鈣離子對SK2通道電流的影響:在電極液游離鈣離子濃度為0mol/L、5×10-7 mol/L、10-6 mol/L膜電位為-130 mV時(shí), SR組SK2通道電流密度分別為-1.43±0.33 pA/pF、-2.92±0.35 pA/pF、-10.11±2.15 pA/pF(n0=7,n5×10-7=6,n10-6=8,p<0.05);AF組SK2通道

11、電流密度分別為-2.17±0.40 pA/pF、-6.83±0.19 pA/pF、-14.47±2.89 pA/pF(n0=4,n5×10-7=3,n10-6=4,p<0.05)。(4)L-型鈣通道與SK2通道電流的相關(guān)性研究:①L-型鈣通道激動劑Bay-K8644對SK2通道電流的影響:在全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下,在電極液游離鈣離子濃度為5×10-7 mol/L,膜電位為-130 mV時(shí),Bay-K8644能增大內(nèi)向整流混合電流。②L-

12、型鈣通道抑制劑 verapamil對 SK2通道電流的影響:在全細(xì)胞穿孔膜片鉗模式下,在電極液游離鈣離子濃度為5×10-7 mol/L,膜電位為-130 mV時(shí),在浴液中加入 verapamil的基礎(chǔ)上,apamin對內(nèi)向整流混合電流無抑制作用。結(jié)論：⑴適當(dāng)濃度的二性霉素B與β-escin混合使用進(jìn)行穿孔膜片鉗實(shí)驗(yàn)可形成穩(wěn)定的全細(xì)胞記錄模式,本技術(shù)方法即可保證胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定,又可使電極液內(nèi)的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而改變細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度

13、,進(jìn)而研究不同[Ca2+]i濃度對 SK2通道電流的調(diào)控。⑵電極液內(nèi)游離鈣離子在各濃度下(0mol/L、5×10-7 mol/L、10-6 mol/L),AF組的SK2通道電流密度均大于SR組。⑶在AF狀態(tài)下,SK2通道電流對Ca2+的敏感性增強(qiáng),與SR組比較,差異顯著,提示SK2通道電流可能參與了AF的發(fā)生發(fā)展。⑷L-型鈣通道的激動劑Bay-K8644使SR組內(nèi)向整流混合電流增大的趨勢,在浴液中加入L-型鈣通道的抑制劑verapami