過氧化氫與維生素C對老年豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流影響的實驗研究.pdf

1、目的：研究氧自由基（oxygen free radidical）供體——過氧化氫（H2O2）及氧自由基清除劑維生素C對老年豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance Ca2+—activated potassium channels，BKCa channels）電流的影響，探討氧自由基及氧自由基清除劑對老年豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞BKCa通道電流的作用機制，以及如何調(diào)節(jié)外毛細(xì)胞的功能狀態(tài)，從而影響老年性聾（presb

2、ycusis）的發(fā)生和發(fā)展，并為臨床預(yù)防、治療老年性聾提供理論依據(jù)和新的思路。 方法：采用急性酶分離方法分離老年豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞和膜片鉗全細(xì)胞記錄模式觀察、記錄BKCa通道電流及其變化。1.細(xì)胞分離選擇耳廓反射靈敏的健康老年雜色豚鼠（250～400g）60只，快速斷頭處死，取出聽泡，耳蝸置入已充氧的冷細(xì)胞外液中；解剖顯微鏡下仔細(xì)剔除耳蝸骨殼，斷開蝸軸，將去除蝸殼的剩余耳蝸移入含Ⅳ型膠原酶（1m/ml）的細(xì)胞外液中消化12分鐘；然

3、后移入裝有浴液并預(yù)先用纖維連接純化蛋白處理底部1小時的浴槽中終止消化。解剖顯微鏡下用微鑷環(huán)形撕除螺旋韌帶，酶消化后的外毛細(xì)胞及部分未充分消化的基底膜即脫落于浴槽中。撕碎解剖鏡下可見的基底膜組織，輕輕吹打后靜置20～30分鐘，使單離的外毛細(xì)胞貼附于浴槽底部，以上操作均在室溫條件（20～25℃）下完成。2.通道電流記錄拉制電極，電極拋光，更換浴液，選擇貼壁良好、立體感強、形態(tài)典型的單離外毛細(xì)胞形成高阻封接。電極施加短促的負(fù)壓，電極尖端吸附的

4、胞膜破裂，形成膜片鉗全細(xì)胞記錄模式。選擇鉗制電壓（VH）為—60mV，從—50mV起除極至+50mV，以10mV為一個階躍，刺激持續(xù)時間400ms，激活BKCa通道，觀察、記錄BKCa通道電流。電流信號經(jīng)膜片鉗放大器放大后，引入記憶示波器及12位A/D、D/A轉(zhuǎn)換器，再輸入計算機用于電流信號采集，采樣頻率為10KH，低通濾波2KH后完成。P—Clamp9.0專用軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。采用電流幅值（Current Amplitude，Am

5、），電流密度（Current density），電流.電壓關(guān)系曲線（Ⅰ—ⅤCurve）作為分析項目。3.鑒別并分析通道特性通過改變指令電壓（VT），觀察、記錄該通道電流的電生理特性，包括通道開放的電壓依賴性，電流幅值，電流密度，電流——電壓曲線。并觀察電流激活、失活時間，是否具有電壓依賴性等。觀察BKCa通道特異性阻斷劑伊比利亞毒素（iberiotoxin，IbTX）對通道活動的影響。4.藥物作用觀察（1）記錄到穩(wěn)定、正常的BKCa通道

6、電流后，向新鮮分離外毛細(xì)胞的2ml浴槽浴液內(nèi)分組加入H2O2稀釋液（0.2mmol/L）0、10、20、40μl，使浴液中H2O2濃度分別為0、1、2、4μmol/L，觀察、記錄不同濃度H2O2對BKCa通道電流的影響。記錄后，用不含藥物的新鮮浴液洗脫，觀察通道電流的恢復(fù)情況。（2）分組向新鮮分離貼壁外毛細(xì)胞的2ml浴槽浴液中加入維生素C溶液（5mg/ml）0、10、20、40μl，使浴液中維生素C濃度分別為0、25、50、100μg/

7、ml，觀察、記錄不同濃度維生素C對BKCa通道電流的影響。（3）先向新鮮分離貼壁外毛細(xì)胞的2ml浴槽的浴液中加入H2O2稀釋液40μl，使浴液中H2O2濃度為4μmol/L，再分組加入維生素C溶液10、20、40μl，使浴液中維生素C終濃度分別為25、50、100μg/ml，觀察、記錄H2O2和維生素C聯(lián)合作用對BKCa通道電流的影響。 結(jié)果：1.膜片鉗全細(xì)胞模式下，記錄到一串幅值較大，快速激活，幾乎不失活的電流，激活電壓大于—

8、40～—30mv，電流隨膜電位的增加而增強，電流幅值不斷增大，并表現(xiàn)出外向整流的特性，記錄的電流無“rundown”現(xiàn)象；IbTX100nmol/L時，通道活動完全阻斷，證實為BKCa通道電流。2.（1）H2O2濃度為1、2、4μmol/L時，BKCa通道電流表現(xiàn)明顯的H2O2濃度依賴性興奮，電流幅值和峰值電流密度隨濃度增加而增大，Ⅰ—Ⅴ曲線上升，新鮮浴液洗脫后通道電流可部分恢復(fù)。用藥3分鐘內(nèi)，當(dāng)VT為+50mv時，加藥各組對比對照組B

9、KCa通道峰值電流密度最大值分別為：1μmol/L組比對照組從22.09±0.27 PA/PF升至27.43±0.51PA/PF，增幅24.17%；2μmol/L組比對照組從22.09±0.27PA/PF升至35.81±0.74 PA/PF，增幅62.11%；4μmol/L組比對照組從22.09±0.27 PA/PF升至43.53±1.09PA/PF，增幅97.06%。（2）各組單獨應(yīng)用維生素C組對BKCa通道電流無明顯影響。（3）H2

10、O24μmol/L+維生素C不同濃度25、50、100μg/ml組時，BKCa通道電流表現(xiàn)濃度依賴性抑制，電流幅值和峰值電流密度隨著維生素C濃度的增加而減小，Ⅰ—Ⅴ曲線下降。用藥3分鐘內(nèi)，當(dāng)VT為+50mv時，各組對比對照組BKCa通道峰值電流密度最大值分別為：25μg/ml維生素C+4μmol/LH2O2組比對照組從43.53±1.09PA/PF降至34.85±0.49PA/PF，增幅為—19.94%；50μg/ml維生素C+4μmo

11、l/LH2O2組比對照組從43.53±1.09PA/PF降至30.63±0.56PA/PF，增幅為—29.64%；100μg/ml維生素C+4μmol/LH2O2組比對照組從43.53±1.09PA/PF降至25.79±0.58PA/PF，增幅為—40.75%。但仍不能恢復(fù)至加藥前正常水平。 結(jié)論：1.本實驗測得的電流為BKCa通道電流，具有大電導(dǎo)、電壓依賴性、快速激活、幾乎不失活，且對BKCa通道特異性阻斷劑IbTX敏感。2.

12、氧自由基供體H2O2可呈劑量依賴性的激活BKCa通道電流，而抗氧化劑維生素C可以呈劑量依賴性的抑制該激活電流，但并不能恢復(fù)到加藥前正常水平。3.實驗結(jié)果證明，在氧自由基供體H2O2對老年豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞BKCa通道電流的影響過程中，存在氧自由基/BKCa途徑，而氧自由基清除劑維生素C則能很大程度逆轉(zhuǎn)該過程。4.推測氧自由基/BKCa途徑可能在抑制外毛細(xì)胞鈣超載及神經(jīng)細(xì)胞損傷中起負(fù)反饋機制，抗氧化劑能有效減輕氧自由基對外毛細(xì)胞BKCa通道