一氧化氮對豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞L-型鈣通道電流影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究一氧化氮(nitricoxide，NO)對豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞L-型鈣通道電流(ICa-L)的影響，探討一氧化氮(NO)對外毛細(xì)胞L-型鈣通道電流(ICa-L)的作用機(jī)制，以及如何調(diào)節(jié)外毛細(xì)胞的功能狀態(tài)，從而影響某些內(nèi)耳疾病的發(fā)生和發(fā)展，為臨床防治梅尼埃病、突發(fā)性耳聾、老年性聾、噪聲性聾等內(nèi)耳疾病提供理論依據(jù)和新的思路。 方法：采用急性酶分離方法分離細(xì)胞和全細(xì)胞膜片鉗記錄通道電流。1.細(xì)胞分離選擇耳廓反射靈敏的健康花斑豚鼠

2、(250～400g)40只，斷頭后取出聽泡，快速將Corti's器暴露于Hanks液中，解剖顯微鏡下去除耳蝸骨殼，保持膜迷路完整，斷軸后取出膜迷路，迅速放入含膠原酶Ⅳ的D'Hanks液中消化10～20分鐘，再置入含鈣的Hanks液中浸浴5分鐘，以便終止消化。再放入預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的浴槽中，顯微鏡下撕去螺旋韌帶，機(jī)械分離出外毛細(xì)胞，靜置10分鐘貼壁后，可用于實(shí)驗(yàn)。2.通道電流記錄取急性酶機(jī)械分離的豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞置于細(xì)胞外液(Ca2

3、+濃度1.8mmol/L)中，用膜片鉗全細(xì)胞記錄方式記錄其L-型鈣通道電流，所得電流通過膜片鉗放大器(AXOPATCH-200B)放大，濾波(10KHz)后輸入計(jì)算機(jī)，采用P-Clamp9.0分析軟件進(jìn)行分析處理，并選用以下分析指標(biāo)：(1)電流幅值(CurrentAmplitude，Am)。(2)電流密度(Currentdensity)。(3)通道電流的電流-電壓關(guān)系曲線(Ⅰ-ⅤCurve)。3.鑒別并分析通道特性通過改變指令電壓(VT

4、)，觀察并記錄該通道電流的電生理特性，包括通道開放的電壓依賴性，電流幅值，電流密度，電流-電壓曲線。并觀察通道電流是否具有“Rundown”現(xiàn)象。觀察L-型鈣通道特異性阻斷劑維拉帕米對通道活動的影響。4.藥物作用觀察(1)記錄到穩(wěn)定的電流后，向浴槽內(nèi)加入新配制好的L-Arg(L-精氨酸)溶液。本實(shí)驗(yàn)中浴槽內(nèi)浴液為2mi，依次向浴槽內(nèi)加入1.0×10-4mol/LL-Arg溶液10.0ul，20.0ul，30.0ul，40.0ul，浴液中

5、藥物的濃度則依次達(dá)0.5×10-6mol/L，1.0×10-6mol/L，1.5×10-6mol/L，2.0×10-6mol/L，觀察并記錄不同濃度L-Arg對ICa-L的作用。再加入等濃度的L-NMMA(NG-甲基-L-精氨酸)，觀察其對L-Arg的拮抗作用。再選用另外的細(xì)胞，同樣在記錄到穩(wěn)定的電流后，依次向浴槽內(nèi)加入1.0×10-4mol/LL-NMMA溶液10.0ul，20.0ul，30.0ul，40.0ul，觀察并記錄不同濃度L

6、-NMMA對ICa-L的作用。(2)以上每次加藥后均用不含藥物的細(xì)胞外液灌洗，觀察通道的恢復(fù)情況。 結(jié)果：1.應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法(whole-cellpatchclamptechnique)，記錄到一電壓依賴性的內(nèi)向電流，該電流在-40mV～-30mV開始激活，當(dāng)VT為0mv時(shí)電流幅值A(chǔ)m達(dá)峰值，反轉(zhuǎn)電位(Vrev)約為+60mV，Ⅰ-Ⅴ曲線為鐘型，并具有明顯的“Rundown”現(xiàn)象。2.記錄到穩(wěn)定的電流后，向浴槽內(nèi)加入L

7、-Arg，通道電流在L-Arg濃度為0.5×10-6mol/L～1.5×10-6mol/L表現(xiàn)為濃度依賴性抑制，用藥后5分鐘內(nèi)各組ICa-L峰值電流密度增幅最大值分別為：0.5×10-6mol/LL-Arg組從3.78±1.40pA/pF降至3.70±1.22pA/pF，增幅為-2.12％(n=5)；1.0×10-6mol/LL-Arg組從3.78±1.40pA/pF降至2.62±0.85pA/pF，增幅為-30.69％(n=5)；1.

8、5×10-6mol/LL-Arg組從3.78±1.40pA/pF降至1.32±0.17pA/pF，增幅為-65.08％(n=5)；但以上濃度的L-Arg均不改變ICa-L的激活電位(-40mV～-30mV)，峰值電位(0mV)和反轉(zhuǎn)電位(+60mV)。洗脫后通道電流部分恢復(fù)。L-Arg濃度超過2.0×10-6mol/L通道電流則表現(xiàn)為激活，用藥后5分鐘內(nèi)ICa-L峰值電流密度從1.32±0.17pA/pF增至2.72±0.15pA/pF

9、，增幅為51.47％(n=5)，洗脫后通道電流可部分恢復(fù)。再加用2.0×10-6mol/LL-NMMA后通道電流被抑制，逐漸恢復(fù)到對照水平，用藥后5分鐘內(nèi)ICa-L峰值電流密度從2.72±0.15pA/pF降至1.35±0.12pA/pF，增幅為-50.37％(n=5)；Am和電流密度變化明顯。記錄到穩(wěn)定的電流后，單獨(dú)向浴槽內(nèi)加入不同濃度L-NMMA，通道電流無明顯變化。 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)測得的電流為鈣電流，具有電壓依賴性、“R

10、undown”現(xiàn)象、對L-型鈣通道的特異性阻斷劑敏感等特性。2.低濃度的NO供體L-Arg可以抑制單離外毛細(xì)胞L-型鈣通道電流，高濃度的NO供體L-Arg則可以激活豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞L-型鈣通道電流，NO供體L-Arg聯(lián)合應(yīng)用NOS拮抗劑L-NMMA可以逆轉(zhuǎn)高濃度L-Arg對通道電流的激活作用。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在NO對耳蝸外毛細(xì)胞L-型鈣通道電流影響的過程中，存在NO/ICa-L途徑。4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)存在抑制Ca