血管平滑肌大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)人工重建的研究.pdf

1、 目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)上的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channels, BKCa)的活動(dòng)直接參與了血管平滑肌的舒張調(diào)節(jié),在血壓維持中起重要作用。在天然細(xì)胞上有關(guān)BKCa通道的動(dòng)力學(xué)特性、通道調(diào)控點(diǎn)、藥物作用靶點(diǎn)等的研究存在一定的局限性,但是將BKCa通道蛋白重建到平面雙分子層脂質(zhì)

2、膜(Panar lipid bilayers ,PLBMs)上則可更好地進(jìn)行以上研究。本實(shí)驗(yàn)旨在摸索建立穩(wěn)定的平面雙分子層脂質(zhì)膜制備方法,并摸索將克隆的血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道蛋白融合其上進(jìn)行單通道電流研究。本項(xiàng)目通過聯(lián)合單通道膜片鉗技術(shù),考馬斯亮藍(lán)染色和免疫印跡法 (Western blot)等方法證實(shí)所建立的人工BKCa通道重建技術(shù)的可行性,為下一步研究BKCa通道調(diào)控點(diǎn)和藥物作用靶點(diǎn)提供技術(shù)支持。方法：(1)PLBMs 實(shí)驗(yàn)：將

3、不同濃度的卵磷脂或不同比例的卵磷脂與膽固醇混合液作為成膜液,采用涂抹法制備PLBMs；實(shí)驗(yàn)中控制膜脂質(zhì)的成分和周圍電解質(zhì)環(huán)境,尋找最佳成膜條件；將含有兩性霉素B的脂質(zhì)體或α-toxin加入膜的一側(cè)溶液內(nèi), 使其與PLBMs融合并形成孔道,觀察孔道形成過程中脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性；(2)重建到PLBMs上的BKCa的單通道實(shí)驗(yàn)：將BKCa通道蛋白重建到PLBMs上進(jìn)行單通道電流記錄,通道信號(hào)經(jīng) BC-535 放大器放大,1KHz 濾波, Clam

4、pex 10.2軟件采集,并經(jīng)Clampfit 10.1軟件分析。(3)轉(zhuǎn)染有BKCaα亞基的人胚腎(human embryonic kidney ,HEK293)細(xì)胞上的BKCa單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn)：該實(shí)驗(yàn)作為重建到脂質(zhì)膜上的BKCa的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。選取立體感強(qiáng)、狀態(tài)好并轉(zhuǎn)染有BKCaα亞基的HEK293細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在對(duì)稱性高鉀溶液中,采用內(nèi)面向外模式(inside-out patch)記錄BKCa的單通道電流。單通道電流信號(hào)經(jīng)CEZ-22

5、00膜片鉗放大器放大,1KHz濾波后輸入計(jì)算機(jī),經(jīng)pClamp 10.0軟件采集記錄,并用Clampfit 10.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(4)考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測(cè)制備的BKCa脂質(zhì)體的純度：收集低滲裂解的轉(zhuǎn)染有BKCaα亞基的HEK293細(xì)胞碎片,經(jīng)20%-38%蔗糖/MOPS密度梯度離心得BKCa脂蛋白體,將BKCa脂蛋白體變性處理后加樣,選擇合適的電壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)印。用BKCaα兔抗人多克隆抗體

6、(1：500)孵育,洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1：10,000)孵育。GEL-Doc凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,Quantity One 軟件分析結(jié)果。結(jié)果：(1)涂抹法制備PLBMs實(shí)驗(yàn)：采用不同濃度卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)制備的 PLBMs 可穩(wěn)定 3.5h ,而用不同比例的卵磷脂( PC )和膽固醇(Cholesteryl,CH)制備的PLBMs可穩(wěn)定2.5h。兩性霉素B及α- toxin形

7、成孔道過程中,脂質(zhì)膜很穩(wěn)定。(2)重建到平面雙分子層脂質(zhì)膜上的BKCa的單通道基本特性：①重建的 BKCa通道電導(dǎo)值大,為 206.8 ±16.86pS (n=4)。②通道具有明顯的電壓依賴性,在-60mV~+60mV的測(cè)試電壓下,隨著細(xì)胞膜電位去極化程度的增加,BKCa 通道的電流幅度(Amplitude, Amp)及通道的開放概率(Open probability, NPo)顯著增加,通道的平均開放時(shí)間(Open time, To)

8、延長(zhǎng),平均關(guān)閉時(shí)間(Close time, Tc)縮短。③通道具有明顯的 Ca2+敏感性,cis/trans 側(cè)浴液中 Ca2+濃度分別分別由 0mM增加到1μM和100μM時(shí),BKCa通道的開放概率(NPo)明顯增加,呈Ca2+激活特性。④BKCa 通道具有 K+選擇性, Cis/Trans 側(cè) K+濃度為140/140mM 時(shí)重建的 BKCa通道反轉(zhuǎn)電位在 0mV 左右(n=4),K+濃度為40/140mM時(shí)重建的BKCa通道反轉(zhuǎn)電

9、位在-30mV左右(n=2),而根據(jù)Nernst方程計(jì)算,K+濃度為140/140mM時(shí),K+平衡電位 (K+equilibrium potential, Ek)為0mV,K+濃度為40/140mM時(shí)Ek為-32.6mV。(3)在 inside-out 模式下,HEK293細(xì)胞上BKCa的單通道的基本特性：①HEK293細(xì)胞上的BKCa通道電導(dǎo)值大,為212.7 ±7.71pS(n=8)。②通道具有明顯的電壓依賴性,在0mV~+60mV

10、的測(cè)試電壓下,隨著細(xì)胞膜電位去極化程度的增加,BKCa通道的電流幅度(Amp)及通道的開放概率(NPo)顯著增加,通道的平均開放時(shí)間(To)延長(zhǎng),平均關(guān)閉時(shí)間( Tc)縮短。③通道具有明顯的Ca2+敏感性,BKCa通道的開放概率(NPo)隨浴液中[Ca2+]free濃度增加明顯增加,呈Ca2+激活特性。(4)考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測(cè)結(jié)果：制備的脂蛋白體(proliposome)含BKCaα亞基,分子量大小為100kD