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1、目的:血管平滑肌細(xì)胞膜上的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKca)在血管舒縮調(diào)控機(jī)制中起著重要的作用。平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors,IP3Rs)和蘭諾定受體(ryanodine receptors,RyRs)介導(dǎo)的Ca2+釋放可引起細(xì)胞內(nèi)局部[ca2+]i顯
2、著增加,激活鄰近胞膜上BKCa通道的開放產(chǎn)生自發(fā)性瞬時(shí)外向電流(spontaneous transient outward currents,STOCs),進(jìn)而引起細(xì)胞膜超極化,電壓依賴性Ca2+內(nèi)流減少,負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。目前多數(shù)研究已證實(shí)在血管平滑肌中,RyR介導(dǎo)的鈣釋放是激活BKca通道開放產(chǎn)生STOCs的最終通路,而作為胞內(nèi)第二信使的三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)與甘油二酯(
3、diacylglycel,DG)在對(duì)BKca通道的調(diào)控中也發(fā)揮了重要作用。前期研究已證實(shí)在inside-out膜片下,IP3對(duì)豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKca通道的單通道活性具有激活作用;在全細(xì)胞構(gòu)型下,三磷酸尿嘧啶核酸(uridine5'-triphosphate,UTP)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的IP3與DG參與了STOCs的調(diào)節(jié),并具有重要的生理意義。由于單通道記錄方法中,細(xì)胞貼附式(cell-attached)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)在環(huán)境的干擾最小,
4、在該膜片形式下記錄到的單通道的活動(dòng)較其它形式更接近生理?xiàng)l件;因此本實(shí)驗(yàn)采用單通道膜片鉗技術(shù),在cell-attached膜片上,進(jìn)一步研究UTP對(duì)急性酶分離的豬冠脈平滑肌細(xì)胞BKca通道的作用,并探討生理?xiàng)l件下UTP誘導(dǎo)產(chǎn)生的IP3對(duì)BKca通道的作用及其機(jī)制,為深入研究血管舒縮及調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:分離新鮮豬心的冠狀動(dòng)脈血管的二級(jí)分支,縱向剖開并斜行剪成2mmx5mm的組織條塊,置于酶液中進(jìn)行兩步法消化。選取貼壁良好,折光性強(qiáng)
5、,具有較強(qiáng)立體感,表面光滑的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取細(xì)胞置于對(duì)稱性高鉀溶液([K+]o:[K+]i=140:140mM)中,用膜片鉗技術(shù)記錄單通道電流,所得電流通過膜片鉗放大器(CEZ-2300)放大,濾波(1KHz)后輸入計(jì)算機(jī),用pCLAMP9.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。將膜電位鉗制于+40mV,在cell-attached膜片上觀察BKca通道電流的變化。實(shí)驗(yàn)方案如下:①研究UTP對(duì)BKca通道的作用。②用UTP預(yù)處理細(xì)胞后,加
6、入磷脂酶C(phospholipase C,PLC)抑制劑U73122,探討PLC在UTP調(diào)控BKca通道中的作用。③加入PK.C特異性激動(dòng)劑PMA;而在另一組實(shí)驗(yàn)中用UTP預(yù)處理細(xì)胞,再加入PKC特異性抑制劑Bis-I,研究DG/PKC信使通路對(duì)UTP調(diào)控BKca通道的影響。④加入IP3R特異性抑制劑2APB,進(jìn)一步研究IP3/ca2+通路在UTP調(diào)控BKca通道活動(dòng)中的意義。⑤記錄了藥物作用前后的通道電流后,灌流浴液5-7次,待通道
7、電流變化穩(wěn)定后,在cell-attached膜片基礎(chǔ)上形成inside-out膜片,并在此膜片上觀察和鑒別BKca通道的特性。結(jié)果:1. 在對(duì)稱性高鉀溶液中,在inside-out膜片上,豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電導(dǎo)值為229.5±8.1pS(n=20),通道具有電壓依賴性和鈣敏感性,以及明顯的鉀離子選擇性,400nM的ChTX能夠完全阻斷通道活動(dòng)。2.在cell-attached膜片上,80μMUTP可明顯激活BKCa通道:B
8、KCa通道開放概率增加,關(guān)閉時(shí)間縮短(P<0.01,n=21)。3.UTP(80μM)預(yù)處理細(xì)胞之后,再向浴液中加入磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122(10μM)可使通道開放概率減小,通道開放時(shí)間縮短,關(guān)閉時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05,n=5)。4.浴液中加入PKC激動(dòng)劑PMA(10nM),BKCa通道開放概率明顯降低((P<0.05,n=6)。5.用UTP(80μM)預(yù)處理細(xì)胞,再向浴液中加入PKC特異性抑制劑Bis-I(1μM),BKC
9、a通道開放概率較加入前明顯增大(P<0.05,n=6)。6.用UTP(80μM)預(yù)處理細(xì)胞,再向浴液中加入IP3R抑制劑2APB(80μM), BKCa通道開放概率降低,通道活動(dòng)受抑制(P<0.05,n=6)。結(jié)論:1.在cell-attached膜片上,UTP能激活豬冠脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道。2.UTP對(duì)BKCa通道的激活作用是通過胞內(nèi)PLC信使轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。3.激活DG/PKC通路中的PKC可以在一定程度上抑制UTP對(duì)BKCa通
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