咖啡因對豬冠狀動脈平滑肌細胞K-,Ca-的調節(jié)作用.pdf

1、目的：鈣離子是細胞內最重要的第二信使之一，對血管平滑肌張力的調節(jié)起重要作用。蘭尼定受體(ryanodinereceptor,RyR)及三磷酸肌醇受體(inositol-1,4,5-triphosphatereceptor,IP3R)是一類位于肌漿網膜上的主要的鈣離子釋放通道，其所介導的胞內鈣庫鈣離子釋放對保持胞內鈣的平衡和平滑肌的正常生理功能起著重要的作用。血管平滑肌細胞膜上鈣激活鉀通道(calcium-activatedpotassi

2、umchannels，KCa)分布廣泛，攜帶了70-80％的外向電流，KCa通道被激活后可引起細胞膜超極化，負反饋引起平滑肌舒張，反之，血管收縮，可見KCa在調節(jié)血管平滑肌張力機制中起重要作用?，F(xiàn)有研究表明：RyR被激活后，可引起肌漿網鈣庫釋放鈣，導致局部鈣離子濃度升高(鈣火花)，激活KCa通道，調節(jié)平滑肌細胞的張力?？Х纫?caffeine)可作用于RyR，引起鈣濃度的瞬變，進而影響KCa通道。在多種動物和多種細胞上已做過一些相關研究

3、，但作為與人心臟構成相似的、容易獲得的研究對象—豬的冠狀動脈，相關研究未見報道，其細胞內肌漿網鈣庫激活后與KCa通道的關系及調控機理還不清楚。因此，本實驗應用膜片鉗單通道電流記錄技術，采用內面向外式(inside-out)、細胞貼附式(cell-attached)兩種方式研究咖啡因對豬冠狀動脈平滑肌細胞KCa通道的調控機理，及蘭尼定(ryanodine)對咖啡因激活的KCa通道作用的影響。 方法：分離豬冠狀動脈，剔除內外膜，保留

4、平滑肌層，縱行剖開后將其剪成2×5mm的組織塊，放入酶液經過酶解后獲得單個平滑肌細胞，分離的細胞在8小時內使用。取急性酶分離的平滑肌細胞置于對稱性高鉀溶液([K+]o：[K+]i=140：140mM)中，用膜片鉗技術記錄單通道電流，所得電流通過膜片鉗放大器(CEZ-2300)放大，濾波(1KHz)后輸入計算機，用PCLAMP9.0軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集及分析。在細胞貼附式膜片和內面向外式膜片上觀察不同濃度咖啡因對KCa通道的影響以及在細胞

5、貼附式膜片上Ryanodine對caffeine激活KCa通道作用的影響。 結果：(1)在對稱性高鉀溶液中，內面向外式膜片下，記錄到豬冠狀動脈平滑肌細胞KCa通道電導值為234.07±7.85pS(n=l5)，具有電壓依賴性及鈣敏感性；在outsiide-out膜片上，400nM的卡律蝎毒素(charybdotoxin，ChTX)能夠完全阻斷通道活動。改變電極液和浴液的鉀離子梯度，記錄到的單通道電流具有明顯的鉀離子選擇性.(2)

6、在inside-out膜片上，0.1、0.5、1.0、5.0mM咖啡因對KCa通道具有明顯的激活作用，隨著濃度增加，KCa通道的開放概率(openprobability,NPo)也增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性。另外，KCa通道平均關閉時間也隨著濃度增加而明顯縮短。5.0mM左右咖啡因對KCa激活程度最大，用不含藥物的浴液洗脫后，通道的活性可以恢復到接近用藥前水平，再加入咖啡因(0.5mM)仍可再次激活KCa，說明咖啡因和作用位點結合是可逆的。

7、浴液鈣離子濃度接近0mM([EGTA]=1mM，[Ca2+]=0mM)時，咖啡因對KCa通道仍有激活作用，提示在內面向外式構型上咖啡因激活KCa通道作用與鈣離子是否存在關系不大。(3)在cell-attached膜片上，當咖啡因達到一定濃度時，KCa通道被激活，咖啡因濃度(0.1-5.0mM)增加，NPo也增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性，開放時間延長，關閉時間也隨之縮短，5.0mM左右咖啡因可最大程度激活KCa通道，用不含藥物的浴液洗脫后，通道

8、活性可一定程度的恢復，再加入一定濃度咖啡因(如1.0mM)可再次激活KCa，激活程度與洗脫前較接近。(4)Ryanodine對咖啡因激活KCa作用的影響：在cell-attached膜片上，加入咖啡因明顯激活KCa通道后，再加入不同濃度的Ryanodine(10、20、40μM)，隨著濃度增加，KCa通道NPo減少，關閉時間(timeofclosuer,Tc)延長，開放時間(opentime，To)縮短。 結論：(1)在內面向外

9、式構型上，咖啡因能直接激活豬冠狀動脈平滑肌細胞KCa通道，有飽和性，這種作用與鈣離子的濃度變化關系不明顯。(2)在細胞貼附式構型上咖啡因濃度依賴性地激活KCa，增加開放概率，延長開放時間，但主要是縮短關閉時間，對KCa的作用有飽和性。Ryanodine可以濃度依賴性地抑制KCa活性，使NPo減少，To縮短，但主要是延長關閉時間。表明咖啡因、Ryanodine可通過影響胞內信號轉導過程而影響KCa活性，或說明二者可能通過共同的靶點(RyR