咖啡因通過腺苷受體介導的免疫細胞調節(jié)作用減輕小鼠EAE的病情.pdf

1、目的:
　　1.不同劑量咖啡因慢性干預作用對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的影響及其分子免疫學機制。
　　2.不同階段咖啡因干預作用對小鼠EAE發(fā)病的影響。
　　3.咖啡因慢性干預作用對A2aR敲除小鼠EAE的影響，進一步明確咖啡因慢性干預抑制EAE發(fā)病的作用機理。
　　方法與內容:
　　SPF級C57BL/6小鼠（野生型及A2aR敲除基因型）小鼠:雌性，8-10周齡，體重16～20g。
　　實驗一:野

2、生型小鼠40只，隨機分為5組（每組8只）:①CFA陰性對照組;②EAE陽性對照組，③咖啡因飲水干預組(1mg·kg-1，10mg·kg-1，30mg·kg-1)。所有EAE模型組小鼠用MOG35-55混合CFA制成抗原乳劑皮內注射，CFA陰性對照組以生理鹽水代替抗原肽制備“抗原乳劑”皮內注射，0、48小時腹腔注射PT造模?？Х纫蚋深A自造模前10天起至EAE造模后第20天與對照組小鼠同期處死為止。自免疫當日定為第0天，每日兩次觀察并記錄動

3、物行為學及體重的變化。采用量化評分法，比較不同咖啡因劑量干預下EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。實驗動物處死后取大腦及腰髓組織制作石蠟標本，用H&E染色觀察評價中樞炎癥細胞浸潤和損害程度。同時用逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)法測定小鼠大腦干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-17(interleukin-17，IL-1

4、7)和轉化生長因子β(transforminggrowth factorβ，TGF-β)及腺苷受體(adenosine receptor，AR) A1R、A2aRmRNA的表達。
　　實驗二:野生型小鼠42只，野生型小鼠42只，以EAE免疫當天定為第0天，至免疫后第20天統(tǒng)一處死小鼠。在EAE發(fā)病不同階段分別給予30mg·kg-1的咖啡因干預:①EAE陽性對照組（10只），無咖啡因干預;②-10天～20天全程干預組(8只)，③-1

5、0天～0天干預組（8只），④0天～10天干預組（8只），⑤10天～20天干預組（8只），⑥CFA陰性對照組（6只）。EAE制模及觀察方法同實驗一。記錄EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。取大腦和腰髓組織制作石蠟標本，用H&E染色觀察評價中樞炎癥細胞浸潤和損害程度，用免疫組織化學法檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質細胞的離子鈣結合受體分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule1，Iba-1)表達。用RT-PC

6、R法測定小鼠IFN-γ、IL-17、TGF-β及A1R、A2aR mRNA的表達。
　　實驗三:野生型小鼠20只，A2aR敲除基因型小鼠20只，分組如下:①野生型CFA陰性對照組（4只），②野生型CFA咖啡因干預組（4只），③野生型EAE陽性對照組（6只），④野生型EAE咖啡因干預組（6只），⑤A2aR敲除CFA陰性對照組（4只），⑥A2aR敲除CFA咖啡因干預組（4只），⑦A2aR敲除EAE陽性對照組(6只)，⑧A2aR敲除EA

7、E咖啡因干預組（6只）。使用30mg·kg-1咖啡因干預自造模前10天起至EAE造模后第20天與對照組小鼠同期處死為止。EAE制模及觀察方法同實驗一。記錄EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。取大腦和腰髓組織制作石蠟標本，用H&E染色觀察評價中樞炎癥細胞浸潤和損害程度，用Luxol Fast Blue(LFB)髓鞘染色檢測中樞髓鞘脫失情況，用免疫組織化學法定量分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質Iba-1表達。用RT-PCR法測定小鼠IFN-γ、IL-17

8、、TGF-β及A1R、A2aR mRNA的表達。
　　結果:
　　1.慢性咖啡因干預組EAE病情嚴重程度降低，最大神經(jīng)功能評分下降，中樞炎癥細胞浸潤程度下降，病理評分降低，促炎因子IL-17、IFN-γ表達降低，抑炎因子TGF-β表達上升。
　　2.經(jīng)咖啡因干預后，-10天～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預組小鼠日均神經(jīng)功能評分低于EAE陽性對照組，與EAE組相比全程組最大神經(jīng)功能評分下降、10天～20天（

9、發(fā)病期）干預組發(fā)病潛伏期延長(P＜0.05)，10天～20天（發(fā)病期）干預組發(fā)病小鼠炎癥細胞、小膠質細胞浸潤相對較輕，咖啡因-10天～20天（全程）干預組炎癥細胞、小膠質細胞浸潤程度為最輕，多分布于脊膜周圍，病理評分-10天～20天（全程）干預組較EAE陽性對照組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。-10天～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預組小鼠促炎因子IL-17低于EAE陽性對照組(P＜0.05)-10天～20天（全程）組小鼠I

10、FN-γ表達亦降低(P＜0.05)，-10天～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預組小鼠抑炎因子TGF-β高于EAE陽性對照組(P＜0.05)，同時-10天產(chǎn)～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預組小鼠A1R表達相對較高(P＜0.05)。
　　3.引入A2aR敲除基因型小鼠進行EAE制模，經(jīng)咖啡因干預后發(fā)現(xiàn):無論野生小鼠還是敲除小鼠，咖啡因干預組均比對照組潛伏期延長(p＜0.05)，最大神經(jīng)功能學評分野生型咖啡因干

11、預組低于野生型EAE組，A2aR敲除型小鼠咖啡因干預亦低于敲除EAE組(p＜0.05)?？Х纫蚋深A組小膠質細胞浸潤較EAE陽性對照組輕，髓鞘脫失狀況也較輕。促炎因子檢測顯示咖啡因干預組IL-17、IFN-γ低于EAE陽性對照組(p＜0.05)，A2aR敲除EAE咖啡因干預組抑炎因子TGF-β表達高于A2aR敲除EAE陽性對照組(p＜0.05)。AR檢測顯示咖啡因干預組A1R的表達均較相應的EAE陽性對照組高(p＜0.05)。
　　

12、結論:
　　1.咖啡因慢性干預對EAE有一定的的保護作用，這一保護作用以30mg·kg-1的高劑量組最為顯著。咖啡因慢性干預可以上調A1R的表達含量，可能主要是通過上調A1R而發(fā)揮對EAE的保護作用。
　　2.-10天～20天（全程）干預組、10天～20天（發(fā)病期）干預組咖啡因減輕EAE的病情主要是通過上調A1R來實現(xiàn);10天～20天（發(fā)病期）干預組咖啡因干預的A1R上升，在-10天～0天（造模前期）干預組、0天～10天（潛

13、伏期）干預組未觀察到，提示咖啡因的上調A1R主要在EAE疾病發(fā)病期起作用（治療作用而非預防作用）。
　　3.咖啡因對A2aR敲除基因型小鼠EAE仍出現(xiàn)一定的保護作用，證明這一保護作用主要是通過A1R來實現(xiàn)的，而非A2aR?？Х纫蜃鳛榉翘禺愊佘帐荏w拮抗劑，在發(fā)病期慢性干預致A1R功能上調，A1R上調可以使促炎因子IL-17、IFN-γ釋放減少，同時抑炎因子TGF-β釋放增加，減少小膠質細胞的細胞毒性，對炎癥細胞浸潤、繼發(fā)性脫髓鞘等起