血管平滑肌細(xì)胞鈣化過(guò)程CaN對(duì)IP3RI的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：動(dòng)脈鈣化是老年人常見(jiàn)的一種異位鈣化的病理現(xiàn)象，它與心肌梗死、腦卒中和猝死等心腦血管疾患密切相關(guān)。血管鈣化既往被認(rèn)為是一個(gè)被動(dòng)過(guò)程，是老年化導(dǎo)致的血管退行性變化。近年的研究顯示血管的鈣沉積是類似于骨形成的主動(dòng)可調(diào)節(jié)過(guò)程，包括血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)等鈣化血管細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、成骨相關(guān)基質(zhì)的表達(dá)和骨樣結(jié)構(gòu)形成。VSMCs表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死等心血管疾

2、病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。
　　 哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含兩個(gè)鈣離子(Ca2+)胞內(nèi)鈣釋放通道，即三磷酸肌醇受體(IP3R)和雷尼丁受體(RyR)。IP3R和RyR是多基因家族的產(chǎn)物。其中IP3R家族至少包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。VSMCs表達(dá)大量IP3RI，而IP3RⅡ、Ⅲ、Ⅳ型則表達(dá)很局限。細(xì)胞外配體與胞漿膜G蛋白受體或酪氨酸激酶受體結(jié)合，激活磷脂酶C(PLC)產(chǎn)生IP3，后者與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3R結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)雜的胞漿鈣濃度信號(hào)（包括瞬間振蕩和鈣波）

3、。IP3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化參與多數(shù)細(xì)胞生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，屬于PP2B家族，是迄今所知的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶。CaN廣泛分布于腦、心肌、骨骼肌、T淋巴細(xì)胞、血管平滑肌和心血管內(nèi)皮等組織細(xì)胞中，主要表達(dá)于胞漿中，由催化亞基A和調(diào)節(jié)亞基B組成異源二聚體。CaN通過(guò)對(duì)底物去磷酸化，參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。近年CaN在誘導(dǎo)心肌肥大中的作用已經(jīng)被認(rèn)識(shí)。目前研究

4、己發(fā)現(xiàn)CaN是細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的下游信號(hào)分子，但是在VSMCs增殖過(guò)程中，CaN能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度。此外，胞內(nèi)鈣離子釋放同時(shí)也受胞漿鈣濃度正負(fù)反饋的調(diào)節(jié)，而且細(xì)胞漿游離鈣濃度變化對(duì)于IP3RⅠ基因的轉(zhuǎn)錄有直接的調(diào)節(jié)作用，而在細(xì)胞鈣化中的CaN對(duì)IP3RⅠ的調(diào)節(jié)作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有報(bào)道。
　　 本試驗(yàn)采用磷酸二氫鈉建立大鼠主動(dòng)脈VSMCs鈣化模型，測(cè)定細(xì)胞IP3RⅠ及CaN mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性，并觀

5、察CaN對(duì)IP3RⅠ表達(dá)的影響，初步探討CaN及IP3RⅠ對(duì)細(xì)胞鈣化的調(diào)節(jié)作用，為細(xì)胞鈣化的臨床防治提供新的思路。
　　 方法：大鼠胸大動(dòng)脈VSMCs傳代培養(yǎng)后，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為3組。A組：對(duì)照組；B組：鈣化組；C組：干預(yù)組（簡(jiǎn)稱CsA組）。A組給予正常對(duì)照的DMEM培養(yǎng)基3ml,B組給予磷酸二氫鈉配制濃度為2mmol/L的DMEM培養(yǎng)基3ml,C組給予磷酸二氫鈉配制濃度為2mmol/L的DMEM培養(yǎng)基3ml同時(shí)加入濃度為5m

6、g/L的免疫抑制劑環(huán)孢霉素A(CsA)30ul，分別培養(yǎng)6天，每3天換液一次，于第6天收集細(xì)胞。茜素紅染色示鈣化組大鼠主動(dòng)脈VSMCs呈梭形或多角形，排列紊亂，可見(jiàn)大量褐色鈣化點(diǎn)，提示細(xì)胞鈣化成功。取材后每組用ELISA法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈VSMCs CaN活性、Ca2+含量，實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定CaNB mRNA和IP3RⅠmRNA, Western blot法測(cè)定CaNB及IP3RⅠ蛋白定量，采用比色法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)

7、活性；所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)茜素紅染色結(jié)果示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈VSMCs呈梭形，排列整齊，未見(jiàn)鈣化點(diǎn)；鈣化組大鼠主動(dòng)脈VSMCs呈梭形或多角形，排列紊亂，可見(jiàn)褐色鈣化點(diǎn)；CsA組大鼠主動(dòng)脈VSMCs呈梭形或多角形，排列

8、紊亂，也可見(jiàn)大量褐色鈣化點(diǎn)。
　　 (2)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法結(jié)果顯示：CsA組與對(duì)照組對(duì)比：CsA組CaNBmRNA(3.38±0.77)較對(duì)照組（1.10±0.28）表達(dá)顯著增加(P＜0.01)；CsA組IP3RⅠmRNA(2.58±0.53)較對(duì)照組（1.02±0.15）表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；鈣化組與對(duì)照組對(duì)比：鈣化組CaNB mRNA(6.27±1.45)較對(duì)照組（1.10±0.28）表達(dá)顯著增加（P＜0.

9、01）；鈣化組IP3RⅠ mRNA表達(dá)（5.90±1.41）較對(duì)照組（1.02±0.15）表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；鈣化組與CsA組對(duì)比：CsA組CaNBmRNA（3.38±0.77）較鈣化組（6.27±1.45）表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。CsA組IP3RⅠ蛋白（2.58±0.53）較鈣化組（5.90±1.41）表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。
　　 (3)Western blot法測(cè)定結(jié)果顯示：CsA組與對(duì)照組對(duì)比：Cs

10、A組CaNB1蛋白（48.22±2.47）較對(duì)照組（29.9±1.39）表達(dá)顯著增加(p＜0.01), IP3RⅠ蛋白(1155.10±71.42)較對(duì)照組（397.87±39.94）表達(dá)也顯著增加(p＜0.01)；鈣化組與對(duì)照組對(duì)比：鈣化組CaNB蛋白（69.11±2.51）較對(duì)照組(29.9±1.39）表達(dá)顯著增加(p＜0.01)，IP3RⅠ蛋白（1865.40±128.57）較對(duì)照組（397.87±39.94）表達(dá)顯著增加(p＜0

11、.01)；CsA組與鈣化組對(duì)比：CsA組CaNB蛋白（48.22±2.47）較鈣化組（69.11±2.51）表達(dá)顯著減少(p＜0.01)，IP3RI蛋白（1155.10±71.42）較鈣化組（1865.40±128.57）表達(dá)顯著減少（p＜0.01）。
　　 (4)ELISA法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈VSMCsCaN活性：鈣化組（21.47±1.86IU/L）較對(duì)照組（14.31±0.24IU/L）表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，CsA組（

12、15.34±0.14IU/L）較對(duì)照組（14.31±0.24IU/L）表達(dá)無(wú)顯著變化(P＞0.05)，CsA組（15.34±0.14IU/L）較鈣化組(21.47±1.86IU/L)表達(dá)顯著減少(P＜0.01)。
　　 (5)ELISA法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈VSMCsCa2+含量：鈣化組（9.01±0.32pg/ml）較對(duì)照組（6.03±0.33pg/ml）Ca2+濃度顯著增加（P＜0.01），CsA組（10.39±0.70pg/ml

13、）較對(duì)照組（6.03±0.33pg/ml）Ca2+濃度顯著增加（P＜0.01），CsA組（10.39±0.70pg/ml）較鈣化組（9.01±0.32pg/ml）Ca2+濃度顯著增加（P＜0.05）。
　　 (6)用比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALP活性(U·g-1 protein)，相對(duì)于對(duì)照組（38.74±2.23），鈣化組的ALP活性（146.04±9.02）顯著增高（P＜0.01），但比CsA組（216.69±14.0）其ALP活性

14、顯著降低（P＜0.01）；CsA組（216.69±14.0）較對(duì)照組（38.74±2.23）顯著增高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用磷酸二氫鈉成功地建立了大鼠主動(dòng)脈VSMCs鈣化模型。
　　 2.本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鈣化VSMCs中IP3RⅠ及CaN mRNA、蛋白的表達(dá)明顯增加，應(yīng)用CsA后IP3RⅠmRNA和蛋白的表達(dá)減低，說(shuō)明在鈣化細(xì)胞中CaN對(duì)IP3RⅠ有激活作用。3CsA可能促進(jìn)細(xì)胞鈣化。<