IL-1β通過H2O2調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道活性機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動(dòng)脈痙攣(coronary artery spasm,CAS)和冠脈粥樣硬化是急性冠脈綜合癥(acute coronary syndrome,ACS)、變異型心絞痛、冠狀動(dòng)脈微血管病性心絞痛等多種心血管疾病的重要病因,嚴(yán)重威脅人類生命健康。CAS發(fā)病率高,2008年公布的CASPAR試驗(yàn)結(jié)果表明,超過1/4的ACS患者沒有明顯的冠脈血管堵塞,其中約50％的患者存在明確的冠脈痙。MICHEL E.為1089名

2、心絞痛患者做冠脈痙攣激發(fā)試驗(yàn),20％的新近心?；颊呒ぐl(fā)試驗(yàn)陽性；靜息心絞痛患者陽性率為38％,而在變異性心絞痛患者中,這一數(shù)據(jù)為85.1％。與冠脈粥樣硬化比較,CAS基礎(chǔ)研究滯后、臨床關(guān)注不夠。目前CAS的發(fā)病機(jī)制尚未明了。傳統(tǒng)學(xué)說認(rèn)為CAS的主要病理發(fā)病機(jī)制是平滑肌細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流增多和內(nèi)皮源性舒張因子缺乏。臨床實(shí)踐中,全身及冠脈內(nèi)使用鈣離子受體阻滯劑(calcium channel blocker,CCB)和NO供體都能一過性緩解冠

3、脈痙攣,然而其遠(yuǎn)期療效不確切。GAS是心血管病病房最棘手的問題之一。闡明冠脈痙攣發(fā)病機(jī)制,尋找新的藥物作用靶點(diǎn)是當(dāng)務(wù)之急。血管平滑肌細(xì)胞膜電位與平滑肌血管舒縮反應(yīng)性密切相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞膜超級(jí)化,促使細(xì)胞膜上電壓依賴性鈣通道(voltage depented calcium channel,VDCC)關(guān)閉,外鈣內(nèi)流減少,導(dǎo)致平滑肌舒張,即所謂的超極化舒張機(jī)制。超極化舒張機(jī)制是內(nèi)皮源性舒張受損的一種重要補(bǔ)償機(jī)制。血管平滑肌細(xì)胞上多種鉀通

4、道開放可使細(xì)胞膜超極化。大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道(Ca2+-activated K+channel,BKca)是血管平滑肌的優(yōu)勢鉀通道,是形成膜電位的重要因?yàn)椤Kca通道敏感于血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、蛋白激酶和細(xì)胞膜電位等與細(xì)胞功能密切相關(guān)的重要信號(hào)。白介素1β(Interleukin-1,IL-1β)與冠心病、心力衰竭、血管痙攣等多種心血管疾病

5、密切相關(guān),上述疾病常伴隨血管平滑肌細(xì)胞膜電位變化。但I(xiàn)L-1β是否通過BKca通道影響膜電位,進(jìn)而影響血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)性狀目前未見報(bào)道。本課題應(yīng)用IL-1β與大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng),運(yùn)用蛋白印記技術(shù)和膜片鉗技術(shù),分析不同時(shí)間點(diǎn)BKca通道蛋白表達(dá)與通道電流(IBK)動(dòng)態(tài)變化；運(yùn)用共聚焦顯微鏡觀察IL-1β通過平滑肌細(xì)胞內(nèi)H2O2對膜電位及IBK影響,旨在闡明BKca通道參與冠脈痙攣的機(jī)制,開創(chuàng)防治冠脈痙攣藥物作用新靶點(diǎn),具有重要

6、的理論和臨床意義。
　　 研究方法
　　 本課題用不同濃度IL-1β與大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(aortal smooth musclecells,ASMC)共培養(yǎng),觀察IL-1β對BKca通道的影響及其時(shí)間動(dòng)態(tài)變化。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察IL-1β對大鼠ASMC膜電位影響的時(shí)間動(dòng)態(tài)變化,分析活性氧簇清除劑catalase、BKca通道阻斷劑IBTX、BKca通道開放劑NS1619對膜電位的影響,并探討其中的關(guān)聯(lián)。為了明確

7、IL-1β通過H2O2對BKca通道活性影響,我們運(yùn)用膜片鉗技術(shù)檢測有或無catalase存在時(shí)高濃度IL-1β對單通道開放幾率Po的作用。全細(xì)胞模式下,觀察不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β對ASMC培養(yǎng)液全細(xì)胞鉀電流IK的影響及IBTX降低IK幅度變化。此外,IL-1β處理細(xì)胞后我們檢測細(xì)胞內(nèi)H2O2動(dòng)態(tài)變化,檢測H2O2對平滑肌細(xì)胞BKca通道NPo的影響,并運(yùn)用WB檢測BKca通道α亞基表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化。
　　 研究結(jié)果
　　

8、 1、IL-1β與ASMCs短時(shí)間共培養(yǎng):①IL-1β處理細(xì)胞30min后,細(xì)胞膜電位較對照組呈劑量依賴性減??；catalase(H2O2清除劑,200U/ml)及IBTX(BKca通道阻斷劑,100nM)存在時(shí),與對照組相比,IL-1β處理細(xì)胞30min膜電位減小無統(tǒng)計(jì)意義；⑦全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(whole-cell mode)檢測發(fā)現(xiàn),與control(生理鹽水)比較,IL-1β30min處理組全細(xì)胞鉀電流IK上調(diào)；與control+

9、IBTX比較,IL-1β30min+IBTX無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:③H2O2檢測試劑盒檢測50 ng/ml IL-1β處理細(xì)胞30min后H2O2水平,與co ntrol比較,H2O2增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(69.1±7.1 VS 32.0±3.2,P(0.01)；④單通道膜片鉗技術(shù)(Inside-out mode)檢測發(fā)現(xiàn),IL-1β30min處理組BK單通道NPo增加；IL-1β30min+catalase處理細(xì)胞NPo減小,與control比較

10、,NPo無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 2、IL-1β與ASMCs長時(shí)間共培養(yǎng):①IL-1β處理細(xì)胞48h后MTT檢測ASMCs活性顯示,與對照組比較,ASMCs活性下降無統(tǒng)計(jì)意義；②IL-1β處理細(xì)胞48h后,細(xì)胞膜電位較對照組呈劑量依賴性增加；catalase及IBTX存在時(shí),與IL-1β48h組相比,膜電位減小有統(tǒng)計(jì)意義；③H2O2檢測試劑盒檢測50 ng/ml IL-1β處理細(xì)胞48h后H2O2水平,與control比較,H20z

11、增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(118.1±11.9 VS 32.0±3.2,P(0.01)；④5 nM 4-AP(Kv通道阻斷劑)存在時(shí),ASMCs膜電位去極化。但50 ng/ml IL-1β48h處理細(xì)胞,與對照組(saline)比較,4-AP以及4-AP+IBTX膜電位變化無統(tǒng)計(jì)意義；⑤全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(whole-cellmode)檢測發(fā)現(xiàn),與control(生理鹽水)比較,IL-1β48h處理組全細(xì)胞鉀電流IK下調(diào)；與control+IBT

12、X比較,IL-1β48h+IBTX無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；⑥單通道膜片鉗技術(shù)(Inside-out mode)檢測發(fā)現(xiàn),IL-1β48h處理組BK單通道NPo減??；IL-1β48h+catalase處理細(xì)胞,與IL-1β48h組比較,NPo增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但與control比較,NPo仍減小有統(tǒng)計(jì)差異:⑦蛋白印跡(western)檢測IL-1β48h處理組對BK通道α亞基表達(dá)量的影響發(fā)現(xiàn),與control比較,α亞基表達(dá)量呈IL-1β劑量依賴性

13、減少。與IL-1β48h處理組比較,IL-1β48h+catalase組α亞基表達(dá)量增加有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)論
　　 (1)IL-1β通過H2O2影響大鼠血管平滑肌細(xì)胞膜電位,其變化呈雙相特征,即IL-1β短時(shí)間處理細(xì)胞,膜電位下調(diào),長時(shí)間處理細(xì)胞則反之；
　　 (2)IL-1β通過H2O2調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞BK通道活性,其調(diào)節(jié)具有雙相特征；即IL-1β短時(shí)間處理細(xì)胞上調(diào)BK活性,長時(shí)間處理細(xì)胞則反之；

14、　　 (3)IL-1β長時(shí)間處理細(xì)胞下調(diào)BK通道結(jié)構(gòu)亞基-α亞基表達(dá)量,這可能是IL-1β長時(shí)間處理細(xì)胞影響B(tài)Kca通道功能的又一機(jī)制；
　　 (4)急性炎癥通過上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞BK活性,導(dǎo)致膜電位下調(diào),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)；慢性炎癥通過下調(diào)BK活性及BK蛋白表達(dá),導(dǎo)致膜電位上調(diào)。H2O2在此過程中起到中介作用。
　　 (5)BKca通道是形成血管平滑肌細(xì)胞膜電位重要因?yàn)?；膜電位與心血管疾病密切相關(guān),BKca通道可能是心血