阿托伐他汀通過(guò)大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道及H2O2逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位影響研究.pdf

1、研究背景:
　　 自九十年代Lippy,Ridker等人的研究證明冠脈粥樣硬化是一種炎癥過(guò)程以來(lái),圍繞炎癥與心血管疾病的基礎(chǔ)研究如火如荼。IL-1β是具有代表性的炎癥因子,大量文獻(xiàn)報(bào)道IL-1β與冠心病、心力衰竭、血管痙攣等多種心血管疾病密切相關(guān),而動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位的變化是上述疾病病理過(guò)程的共同特征[1-3]。膜電位與細(xì)胞代謝、增殖、遷移等多種生物學(xué)行為有關(guān)。已有報(bào)道IL-1β在血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、P12細(xì)胞、頸動(dòng)脈體

2、細(xì)胞等多種類型細(xì)胞中抑制鉀通道開(kāi)放[4-7],進(jìn)而影響膜電位。血管平滑肌細(xì)胞膜電位與平滑肌血管舒縮反應(yīng)性密切相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞膜超級(jí)化,促使細(xì)胞膜上電壓依賴性鈣通道(VDCC)關(guān)閉,外鈣內(nèi)流減少,導(dǎo)致平滑肌舒張,即所謂的超極化舒張機(jī)制。超極化舒張機(jī)制是內(nèi)皮源性舒張受損的一種重要補(bǔ)償機(jī)制[8]。血管平滑肌細(xì)胞上多種鉀通道開(kāi)放可使細(xì)胞膜超極化。大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道(Bkca)是血管平滑肌的優(yōu)勢(shì)鉀通道,是形成膜電位的重要原因[9-11]。Bk

3、ca通道敏感于血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、活性氧簇(ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、蛋白激酶和細(xì)胞膜電位等與細(xì)胞功能密切相關(guān)的重要信[12-17]。從“電-化學(xué)”角度推測(cè),IL-1β通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞膜電位對(duì)細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)生影響。他汀類藥物自1976年上市應(yīng)用于臨床治療以來(lái),其非調(diào)脂作用,近些年來(lái)越來(lái)越引起人們的重視,一系列國(guó)內(nèi)外大規(guī)模、隨機(jī)、前瞻性研究均表明,他汀類藥物能夠顯著降低心血管事件發(fā)病率及死亡率,從而使他汀類藥物在心血管

4、疾病預(yù)防及治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。尤其是近些年來(lái)隨著臨床及基礎(chǔ)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)他汀類藥物除調(diào)脂作用以外,還具有抑制炎癥、改善內(nèi)皮功能、抗血小板聚集、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊以及抗心律失常等作用。相對(duì)于其調(diào)脂作用,他汀類藥物具有更強(qiáng)的心血管保護(hù)作用,其中他汀類藥物抗炎作用正是其調(diào)脂外作用的重要內(nèi)容[18-19]。大量研究認(rèn)為,他汀類藥物通過(guò)下調(diào)小G蛋白-RHO、上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞

5、內(nèi)一氧化氮(NO)水平[20],另外他汀類藥物作為一種活性氧簇(ROS)清除劑可有效下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。而NO及ROS是確切的Bkca道活性調(diào)節(jié)制劑[21,22]。已有報(bào)道阿托伐他汀可直接開(kāi)放血管內(nèi)皮細(xì)胞Bkca通道進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞膜電位[23]。有理由推測(cè),他汀類藥物可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞Bkca通道并因此調(diào)節(jié)其膜電位從而發(fā)揮生物學(xué)作用。目前阿托伐他汀對(duì)血管平滑肌細(xì)胞Bkca通道活性及其膜電位的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題運(yùn)用共聚焦顯微鏡

6、技術(shù)和膜片鉗技術(shù),以特異性Bkca通道阻斷劑為背景,觀察阿托伐他汀對(duì)血管平滑肌細(xì)胞膜電位及Bkca通道活性影響。并探討在炎癥病理生理情況下,阿托伐他汀能否逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)血管平滑肌細(xì)胞膜電位及Bkca通道活性的影響及其可能機(jī)制,對(duì)豐富他汀類藥物適應(yīng)癥,指導(dǎo)臨床具有重大意義。
　　 研究方法:
　　 本課題用阿托伐他汀處理大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(ASMCs),觀察在生理及炎癥病理情況下阿托伐他汀對(duì)大鼠ASMC膜電位及Bkca

7、通道的影響。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度阿托伐他汀對(duì)大鼠ASMC膜電位的影響,分析在有無(wú)IL-1β情況下,阿托伐他汀對(duì)大鼠ASMC膜電位的影響,并探討其中的關(guān)聯(lián)。為了明確阿托伐他汀對(duì)BKca通道活性影響,我們運(yùn)用單通道膜片鉗技術(shù)內(nèi)面向外模式檢測(cè)有或無(wú)IL-1β存在時(shí),阿托伐他汀對(duì)BKca單通道開(kāi)放幾率Po的作用。全細(xì)胞模式下,觀察阿托伐他汀對(duì)ASMC培養(yǎng)液全細(xì)胞鉀電流IK的影響及IBTX降低IK幅度變化。此外,阿托伐他汀處理與IL-

8、1β共培養(yǎng)的ASMCs后我們檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2動(dòng)態(tài)變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、生理情況下阿托伐他汀對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位及大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道活性影響的研究
　　 (1)生理情況下阿托伐他汀對(duì)ASMCs膜電位的影響
　　 ①ASMCs與各濃度組阿托伐他汀(10、25、50、100、150umol/L)共培養(yǎng)6h后,與對(duì)照組(saline組)比較,膜電位超級(jí)化,表現(xiàn)為細(xì)胞熒光值下降,且下降呈阿托

9、伐他汀濃度依賴性,在阿托伐他汀100umol/L組表現(xiàn)出最大效應(yīng)。②我們引入BKea通道的特異性阻斷劑IBTX(100nM),運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察對(duì)照組(control組)、100umol/L阿托伐他汀處理組、IBTX處理組、100umol/L阿托伐他汀+IBTX處理組,各組作用下細(xì)胞膜電位變化。結(jié)果表明,IBTX完全阻斷了阿托伐他汀對(duì)ASMCS膜電位的影響,說(shuō)明BKca通道介導(dǎo)阿托伐他汀對(duì)ASMCs膜電位調(diào)節(jié)作用。
　　

10、(2)生理情況下阿托伐他汀對(duì)IBTX敏感的全細(xì)胞鉀電流影響
　　 以電流密度(PA/PF)為指標(biāo),以鉗制電壓為+50mv為例。Saline組內(nèi),+IBTX時(shí)電流密度較-IBTX時(shí)減小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明BKca通道是ASMCs生理狀態(tài)下鉀電流的重要組成部分。在全細(xì)胞膜片鉗試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀組全細(xì)胞鉀電流明顯增大有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(與saline組比較),且此增大電流對(duì)IBTX敏感。表現(xiàn)為阿托伐他汀組內(nèi),+IBTX時(shí)電流密度較-I

11、BTX時(shí)減小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明阿托伐他汀處理ASMCs時(shí)全細(xì)胞鉀電流增加,Bkca通道電流增加參與其中。
　　 (3)生理情況下阿托伐他汀調(diào)節(jié)ASMCs上BKca單通道活性
　　 以開(kāi)放概率Npo為指標(biāo),觀察+/-atorvastatin時(shí)BKca通道單通道活性變化。Atorvastatin處理組,與saline組比較,Npo明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、炎癥病理情況下阿托伐他汀對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電

12、位及大電導(dǎo)鈣敏感鉀通道活性影響的研究
　　 (1)阿托伐他汀可以完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平的升高
　　 H2O2檢測(cè)試劑盒檢測(cè)50ng/mlIL-1β處理ASMCs12h后細(xì)胞內(nèi)H2O2水平,與control比較,H2O2增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;catalasc(H2O2清除劑,200U/ml)+IL-1β處理組,catalase可完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平的升高;atorv

13、astatin(100umol/L)+IL-1β處理組,atorvastatin同樣可完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs細(xì)胞內(nèi)H2O2水平的升高;catalase與atorvastatin無(wú)協(xié)同作用,IL-1β+catalaSe+atorvastatin處理組與IL-1β+atorvastatin處理組比較,H2O2變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-1β處理組與control組比較,H2O2水平增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而其它三組(IL-1β+catal

14、aSe處理組,IL-1β+atorvastatin處理組,IL-1β+catalaso+atorvastatin處理組)與control組比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)阿托伐他汀可以完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs去極化
　　 結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,IL-1β處理組,S0ng/L的IL-1β與ASMCs共培養(yǎng)12h明顯使AsMCs膜去極化;catalase(H2O2清除劑,200U/ml)+IL-1β處理組,c

15、atalase可以完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs膜去極化;atorvastatin(100umol/L)+IL-1β處理組,atorvastatin不僅可以完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs膜去極化,而且在某種程度上可以引起ASMCs膜超極化;atorvastatin+catalase+IL-1β處理組,atorvastatin+catalase亦可不僅完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的ASMCs膜去極化,而且在某種程度上引起ASMCs膜超極

16、化,而且與atorvastatin+IL-1β處理組比較,兩組沒(méi)有協(xié)同效應(yīng)。
　　 (3)炎癥病理情況下阿托伐他汀調(diào)節(jié)ASMCs上BKca單通道活性
　　 以開(kāi)放概率(Npo)為指標(biāo),觀察+/-atorvastatin(10umol/L)及+/-catalase(H2O2清除劑,200u/ml)時(shí)IL-1β(50ng/L的IL-1β與ASMCs共培養(yǎng)12h)對(duì)BKca通道單通道活性影響。IL-1β單獨(dú)處理組,與salin

17、e組比較,Npo明顯減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β+catalase處理組,與saline組比較,Npo改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與IL-1β單獨(dú)處理組比較,Npo明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Atorvastatin單獨(dú)處理組,與saline組比較,Npo明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與IL-1β單獨(dú)處理組比較,Npo明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β+atorvastatin處理組,與saline組比較,Npo增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與IL-1β單獨(dú)處理組比

18、較,Npo明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β+catalase+atorvastatin處理組,與saline組比較,Npo增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與IL-1β單獨(dú)處理組比較,Npo明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與IL-1β+atorvastatin處理組比較,Npo變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說(shuō)明catalaLse與atorvastatin兩者沒(méi)有協(xié)同作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、生理情況下阿托伐他汀下調(diào)ASMCs膜電位,即使平滑肌細(xì)胞超

19、極化,且此調(diào)節(jié)具有濃度依賴性特征,阿托伐他汀濃度為100umol/L時(shí)影響最大;
　　 2、生理情況下阿托伐他汀可直接開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞BKca通道,進(jìn)而影響ASMCs膜電位:
　　 3、炎癥病理情況下IL-1β上調(diào)ASMCs內(nèi)H2O2水平,而阿托伐他汀可以完全逆轉(zhuǎn)IL-1β引起的H2O2水平的升高;
　　 4、12小時(shí)50ng/mIL-1β的處理使ASMCs細(xì)胞膜去極化,而100umol/L阿托伐他汀可以逆轉(zhuǎn)I

20、L-1β引起的ASMCs去極化;阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)血管平滑肌細(xì)胞膜電位的影響是部分通過(guò)直接開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞BKca通道,部分通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)H2O2水平介導(dǎo)的;
　　 5、12小時(shí)50ng/mlIL-1β的處理抑制ASMCs細(xì)胞膜上BKca通道活性,而10umol/L阿托伐他汀可以逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)BKca通道活性的影響;阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)BKca通道活性的影響是部分通過(guò)直接開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞BKca通道,部分通過(guò)