雷帕霉素聯(lián)用阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷大鼠血管平滑肌細胞的影響.pdf

1、研究背景：
　　 動脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，也是冠心病的病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)膜的灶狀纖維化，粥樣斑塊形成，致管壁變硬、管腔狹窄，并引起一系列繼發(fā)性病變。血管平滑肌細胞作為血管壁的重要組成部分，在動脈粥樣硬化的整個病理變化中都起了作用。氧化應(yīng)激損傷是動脈粥樣硬化形成的一個重要機制。而血管平滑肌細胞在氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下的病理性增殖等一系列繼發(fā)改變，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起了重要作用，亦是形成支架內(nèi)再狹窄的重要原因。因

2、此抗炎抗氧化和抑制平滑肌細胞增殖是實現(xiàn)抗動脈粥樣硬化及抑制支架內(nèi)再狹窄的重要途徑。
　　 阿托伐他汀作為治療動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)藥物他汀類中的一種，現(xiàn)已有多項研究證實阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化，抑制血管平滑肌細胞增殖的作用。以上這些作用也是阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的重要機制之一。雷帕霉素做為一種免疫抑制劑，通過與相應(yīng)免疫嗜素RMBP結(jié)合抑制細胞周期G0期和G1期，阻斷G1進入S期而發(fā)揮作用，現(xiàn)普遍應(yīng)用于藥物洗脫支架中，以達到減少血

3、管壁對損傷修復(fù)過程中血管平滑肌細胞及新生內(nèi)膜的過度增生造成的再狹窄。另有文獻指出，雷帕霉素抑制血管平滑肌細胞增殖的同時可能造成血管平滑肌細胞的失功能性，但目前對于該方面的研究較少，且存在著較多爭議，特別是對氧化應(yīng)激損傷血管平滑肌細胞的影響研究甚少。此外，雷帕霉素聯(lián)用阿托伐他汀對血管平滑肌細胞增殖等的影響仍缺少文獻支持。因此，本實驗以氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下的大鼠血管平滑肌細胞作為模型，通過應(yīng)用阿托伐他汀以及不同劑量的雷帕霉素干預(yù)氧化應(yīng)激損傷狀

4、態(tài)下的大鼠血管平滑肌細胞，并運用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討兩種藥物對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠平滑肌細胞的影響。
　　 目的：
　　 以大鼠主動脈分離后原代培養(yǎng)的血管平滑肌細胞為研究對象，在三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)下使其處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)，運用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如水溶性四唑鹽(WST)-1法、水溶性四唑鹽(WST)-8法、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase C

5、hain Reaction，RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等，觀察阿托伐他汀以及不同劑量的雷帕霉素對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠平滑肌細胞的增殖、氧化損傷等的影響。旨在為兩種藥物在臨床對動脈粥樣硬化的治療，以及對支架植入術(shù)后支架再狹窄的影響提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 取雄性wistar大鼠，體重180-200 g，斷頭處死，無菌條件下取主動脈并剝?nèi)ネ饽ず蛢?nèi)膜，應(yīng)用組織貼塊法進行大鼠主動脈平滑肌

6、細胞原代培養(yǎng)，細胞經(jīng)α-平滑肌激動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SM-actin）抗體免疫組織化學(xué)鑒定，實驗取用4-6代細胞。
　　 細胞毒性檢測：
　　 實驗分組:1）正常對照組2）t-BHP(40μmol/L組)3) t-BHP(60μmol/L組)4) t-BHP(80μmol/L組)5）t-BHP(100μmol/L組)6）t-BHP(200μmol/L組);放入孵育箱分別干預(yù)12h、24

7、h、48h、72h，采用CCK8試劑盒，應(yīng)用水溶性四唑鹽(WST)-8法檢測細胞存活率，目的是摸索t-BHP誘導(dǎo)主動脈平滑肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型的濃度及時間。最后確定干預(yù)濃度為60μmol/L，24小時。
　　 雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞增殖率的影響:實驗分組:空白組、DMSO組、阿托伐他?。?μmol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100

8、組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實驗各組細胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時后，加入三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時，采用CCK8試劑盒，應(yīng)用水溶性四唑鹽(WST)-8法檢測細胞增殖率。
　　 雷帕毒素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力水平的影響:實驗分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀(3μmol/L)組（A3組）、雷帕霉素50nm

9、ol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實驗各組細胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時后，加入三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時，采用水溶性四唑鹽(WST)-1法檢測細胞內(nèi)SOD活力水平。
　　 雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平的影響:實驗分組:空白組、DMSO組、阿托伐他?。?μm

10、ol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組(R100組)、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實驗各組細胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時后，加入三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時，采用硫代巴比妥酸法，檢測細胞內(nèi)MDA水平。
　　 細胞衰老相關(guān)β-半乳糖糖苷酶(SA-β-Gal)染色:實驗分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀(3μmol/L

11、)組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。實驗各組細胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時后，加入三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時，采用由碧云天公司細胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒，顯微鏡下觀察細胞，計數(shù)藍染的細胞為陽性細胞，每次隨機挑選500個細胞，得到陽性細胞百分率，為衰老細胞的百分率。
　　

12、 雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)皮型NO合成酶(eNOS) mRNA表達的影響:實驗分組:空白組、DMSO組、阿托伐他汀（3μmol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L）。實驗各組細胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時后，加入三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時，總RNA采

13、用Trizol試劑盒提取，實時熒光定量(RT-PCR)進行相對定量檢測血管平滑肌細胞eNOS mRNA的表達量。
　　 雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)皮型NO合成酶(eNOS)蛋白表達的影響:實驗分組:空白組、DMSO組、阿托伐他?。?μmol/L）組（A3組）、雷帕霉素50nmol/L組（R50組）、雷帕霉素100nmol/L組（R100組）、聯(lián)用組（阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol

14、/L）。實驗各組細胞給予相應(yīng)藥物干預(yù)2小時后，加入三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷24小時，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，取適當(dāng)量蛋白，利用Western blot蛋白免疫印跡法測定血管平滑肌細胞中一氧化氮合成酶(eNOS)蛋白的表達情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞增殖率的影響:統(tǒng)計結(jié)果表明，與空白組細胞增殖率（96.68±1.85％）相

15、比，其余五組細胞增殖率均明顯下降（P均小于0.01）。與DMSO組（76.97±5.48％）相比，四個藥物干預(yù)組增殖率也明顯下降，增殖率分別為單純阿托伐他汀(A3)組（64.99±3.82％）、小劑量雷帕霉素(R50)組（62.27±7.10％）、大劑量雷帕霉素(R100)組（54.34±9.09％）和聯(lián)合用藥(R100+A3)組（38.09±6.07％），P均小于0.01。單純阿托伐他汀和小劑量雷帕霉素組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。而大劑量

16、雷帕霉素組細胞增殖率低于A3組(P=0.005)和小劑量R50組（P=0.030）。聯(lián)合用藥組細胞增殖率較以上所有組均明顯下降(P=0.000)。
　　 2、雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力水平的影響:6組細胞的SOD活力水平分別為:93.88±5.79(U/mgprot),92.08±12.05(U/mgprot),107.56±8.88(U/mgprot),109.91±

17、13.31(U/mgprot),125.17±12.48(U/mgprot),140.53±8.42(U/mgprot)。統(tǒng)計結(jié)果表明，與空白組細胞相比較，DMSO組細胞SOD活力水平無明顯差異。而其余4組藥物干預(yù)組細胞SOD活力水平明顯高于空白組和DMSO組（P均小于0.05）。單純阿托伐他汀組和小劑量雷帕霉素組之間細胞SOD活力水平無明顯差異。大劑量雷帕霉素組細胞SOD活力水平明顯高于A3組（P=0.007）和小劑量R50組（P=0

18、.013）。聯(lián)合用藥組細胞SOD活力則明顯高于以上所有組（P＜0.05）。
　　 3、雷帕霉素及阿托伐他汀對氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平的影響:6組細胞的MDA水平分別為:2.26±0.32(nmol/mgprot)，2.04±0.19(nmol/mgprot),1.41±0.33(nmol/mgprot),1.35±0.35(nmol/mgprot),0.99±0.25（nmol/mgprot），0

19、.62±0.21(nmol/mgprot)。統(tǒng)計結(jié)果表明，與空白組細胞相比較，DMSO組細胞的MDA水平無明顯差異。而其余4組藥物干預(yù)組細胞MDA水平與空白組和DMSO組相比則明顯降低(P均小于0.05)。單純阿托伐他汀組和小劑量雷帕霉素組之間細胞MDA水平無明顯差異。大劑量雷帕霉素組其細胞MDA水平明顯低于A3組和小劑量R50組(P均小于0.05)。聯(lián)合用藥組細胞MDA水平較以上所有組均明顯降低(P＜0.05）。
　　 4、各

20、組細胞衰老相關(guān)β-半乳糖糖苷酶(SA-β-Gal)染色陽性率的比較
　　 6組細胞SA-β-Gal染色陽性率分別為:28.93±2.39％，26.11±3.15％，13.05±1.68％，12.29±1.28％，4.98±1.09％，2.38±0.83％。統(tǒng)計結(jié)果表明，與空白組細胞相比較，DMSO組SA-β-Gal染色率無明顯差異。而其余4組藥物干預(yù)組細胞SA-β-Gal染色率與空白組和DMSO組相比則明顯降低(P均小于0.05

21、)。單純阿托伐他汀組和小劑量雷帕霉素組之間染色率無明顯差異。大劑量雷帕霉素組細胞SA-β-Gal染色率明顯則低于A3組和小劑量R50組(P均小于0.05)。聯(lián)合用藥組細胞SA-β-Gal染色率較以上所有組均明顯降低。
　　 5、實驗各組細胞eNOS mRNA和蛋白的表達
　　 通過多次采用RT-PCR和Western blot方法檢測細胞eNOS mRNA和蛋白表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eNOS無論基因水平還是蛋白水平在Wist

22、ar大鼠主動脈血管平滑肌細胞上均無表達。
　　 結(jié)論：
　　 1)阿托伐他汀及雷帕霉素均能抑制氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠血管平滑肌細胞的增殖，兩藥聯(lián)用的抑制作用大于兩種藥物單獨應(yīng)用。
　　 2)阿托伐他汀及雷帕霉素均能提高氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠血管平滑肌細胞的SOD活力水平，兩藥聯(lián)用優(yōu)于兩藥單獨應(yīng)用。
　　 3)阿托伐他汀及雷帕霉素均能降低氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下大鼠血管平滑肌細胞的MDA水平，兩藥聯(lián)用優(yōu)于兩藥單獨