臍動脈血管平滑肌中BKca通道與子癇前期的相關性研究.pdf

1、目的：子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期特有的多系統(tǒng)疾病，嚴重危及孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的生命健康。全身小血管痙攣為該病基本病理變化[1]，其中 BKca通道(Large conductance calcium activated potassium channels，BKca）是調節(jié)血管舒縮功能中最關鍵離子通道。本實驗采用免疫組化、實時熒光定量PCR（QPCR）和Western blotting技術檢測臍動脈血管平滑肌中 BK

2、ca通道陽性率、mRNA水平和蛋白表達水平，了解臍動脈血管平滑肌中 BKca通道的表達和功能的改變，探討臍動脈血管平滑肌中 BKca通道與子癇前期的關系。再此基礎上，進一步探討臍動脈血管平滑肌中 BKca通道的改變與胎兒生長受限（FGR）的關系。為探索子癇前期的發(fā)病機制，并從中尋找有效防治子癇前期及重度子癇前期合并胎兒生長受限的靶點提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　方法：（1）HE和疫組化：收集經(jīng)剖宮產(chǎn)或經(jīng)陰道分娩的臍動脈正常妊娠組（

3、NP組）和子癇前期組（PE組）各30例作為研究對象，快速分離臍動脈，部分臍動脈用10％甲醛固定（其余臍動脈用不同的凍存管分裝，用于實時熒光定量 PCR和免疫印跡實驗），石蠟包埋，然后分別按照 HE染色和免疫組化步驟逐一進行，照相并比較 BKca通道在 NP組和 PE組臍動脈血管平滑肌中表達有何不同。（2）實時熒光定量 PCR(QPCR）：提取臍動脈血管平滑肌總RNA，測出 RNA濃度，將適量 RNA逆轉錄成 cDNA，通過 QPCR反應

4、得到相應的△Ct值，并換算成ΔΔCt值，ΔΔCt值=病例組ΔCt-正常組ΔCt,計算出2-△△Ct值進行 t檢驗分析，比較 NP組和 PE組所檢測基因 BKcaαmRNA、BKcaβ1 mRNA水平的差異。（3）Western blotting：液氮研磨臍動脈組織至粉末狀，加1ml蛋白裂解液提取樣本蛋白；樣本蛋白電泳，轉至PVDF膜上，抗體孵育后，成像系統(tǒng)顯像保存，用Quantity-One軟件測量灰度值分析，應用 SPSS17.0軟進

5、行t檢驗分析，比較 NP組和PE組臍動脈血管平滑肌中 BKcaα亞基、BKcaβ1亞基蛋白相對表達量的差別。再此基礎上進一步比較正常妊娠組、子癇前期組和慢性高血壓合并子癇前期組臍動脈血管平滑肌中 BKcaα亞基、BKcaβ1亞基蛋白相對表達量的差異；比較重度子癇前期合并胎兒生長受限組及無胎兒生長受限組臍動脈血管平滑肌中BKcaα亞基、BKcaβ1亞基蛋白相對表達量的差異。結果以均數(shù)加減標準差（xˉ±s）表示，P＜0.05，P＜0.01均

6、具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:（1）①HE染色:NP組和 PE組各30例均為符合實驗要求的臍動脈，HE染色后鏡下觀察，可見臍動脈血管平滑肌細胞呈長梭形，肌層稍厚，胞漿紅染，胞核位于中央，單核，藍染。臍動脈在子癇前期疾病狀態(tài)下可能會出現(xiàn)血管平滑肌排列紊亂，但未見形態(tài)結構改變和動脈粥樣硬化。②免疫組化：采用定性、半定量法分析。BKcaα亞基和β1亞基在NP組與PE組臍動脈血管平滑肌中均有表達。BKcaα亞基和β1亞基主要表達于臍動脈血管

7、平滑肌胞膜，部分表達于胞漿中。BKcaα亞基的陽性率在 NP組和PE組臍動脈血管平滑肌中無明顯差異；PE組臍動脈血管平滑肌中 BKcaβ1亞基表達強度較 NP組明顯增強，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。（2） QPCR實驗結果:數(shù)據(jù)采用相對定量分析，即2-△△Ct法。BKcaα亞基mRNA水平在兩組中無統(tǒng)計學差異（P=0.808＞0.05）。與 NP組比較，PE組臍動脈血管平滑肌中 BKcaβ1亞基 mRNA水平明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義

8、（P=0.015＜0.05）。（3）Western blotting實驗結果：① BKcaα亞基蛋白表達水平在 NP組和 PE組臍動脈血管平滑肌中無統(tǒng)計學差異(P=1.000＞0.05)；與 NP組比較，PE組臍動脈血管平滑肌中 BKcaβ1亞基蛋白表達水平上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。②正常妊娠組、子癇前期組和慢性高血壓合并子癇前期組：與正常妊娠組比較，BKcaα亞基蛋白表達水平在三組中均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。與正常

9、妊娠組比較，BKcaβ1亞基蛋白表達水平在子癇前期組臍動脈血管平滑肌中表達明顯上調；在慢性高血壓合并子癇前期組臍動脈血管平滑肌中表達明顯下調；與子癇前期組比較，BKcaβ1亞基蛋白表達水平在慢性高血壓合并子癇前期組臍動脈血管平滑肌中表達水平下調更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P1＜0.05，P2＜0.05，P3＜0.01）。③比較重度子癇前期合并胎兒生長受限組和無胎兒生長受限組：BKcaα亞基蛋白相對表達量在兩組中表達無明顯差異（P＞0.0

10、5）；BKcaβ1亞基蛋白相對表達量在重度子癇前期合并胎兒生長受限臍動脈血管平滑肌中表達水平有所下調，差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05）。
　　結論：（1）臍動脈在子癇前期疾病狀態(tài)下，會出現(xiàn)血管平滑肌細胞排列紊亂，但未見形態(tài)結構改變和動脈粥樣硬化。（2）PE組與 NP組比較，臍動脈血管平滑肌中 BKcaα亞基的表達無明顯差異（P＞0.05），BKcaβ1亞基表達水平明顯升高（P＜0.05）。提示BKcaβ1亞基的改變可能與 PE