PKA對慢性心房顫動患者心房肌細(xì)胞SK2通道的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:心房顫動（Atrial fibrillation，AF）簡稱房顫，是臨床上最常見的持續(xù)性心律失常之一，具有較高發(fā)病率和死亡率，發(fā)病率隨年齡增長而增加。調(diào)查研究顯示一般人群AF患病率為1％～2％，且AF患者腦卒中發(fā)生率增加5倍，嚴(yán)重影響人群生存質(zhì)量。目前AF發(fā)生的電生理和分子病理機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明。心房肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣調(diào)控異常及心房肌細(xì)胞跨膜離子流的改變而引起的心房電重塑在AF的發(fā)生和維持中起重要作用。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small

2、 conductance Ca2+-activated K+ channels，SK)的其中一種亞型SK2主要在心房肌中分布。SK2通道在人與鼠的心房肌和心室肌表達(dá)存在差異，在心房肌表達(dá)更為豐富。SK2通道對細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子[Ca2+]i高度敏感，能夠?qū)Ca2+]i的變化快速轉(zhuǎn)換成細(xì)胞膜電位變化，是近年來AF機(jī)制研究的熱點(diǎn)離子通道之一。已證實(shí)，AF時心房肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣紊亂，發(fā)生胞內(nèi)鈣超載;另一方面，SK2通道鈣離子敏感性增加。因此我們推

3、測心房肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣超載及SK2通道鈣離子敏感性的變化可能影響SK2通道功能，SK2通道功能改變參與AF的發(fā)生和維持，深入探討這些問題對闡明AF發(fā)生的病理生理機(jī)制具有重要意義。此外，蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)參與了AF時胞內(nèi)鈣紊亂的病理過程，且對SK2通道的調(diào)節(jié)作用在表達(dá)細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)得到充分證明，但其對心房肌細(xì)胞SK2通道的調(diào)控作用尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀測AF患者心房肌細(xì)胞SK2通道功能的改變

4、及PKA相關(guān)途徑對SK2通道電流的調(diào)節(jié)，旨在從細(xì)胞水平探討PKA通過影響SK2通道功能參與AF電重構(gòu)過程。
　　方法:
　?。ㄒ唬╇娚韺?shí)驗(yàn)將30例（細(xì)胞n=32）接受體外循環(huán)手術(shù)患者標(biāo)本分為兩組:房顫組(AF)10例（細(xì)胞n=11），竇性組(SR)20例（細(xì)胞n=21）。人心房肌細(xì)胞的獲得:獲取體外循環(huán)術(shù)中切除的右心耳組織，在氧飽和Cardiplegic液中清洗并將組織剪成約1mm3的小塊，采用本實(shí)驗(yàn)室改良的急性酶分離方法

5、進(jìn)行兩步酶消化:酶Ⅰ液(ⅩⅩⅣ蛋白酶12.2U/ml，Ⅴ膠原酶150U/ml，BSA1mg/ml)，酶Ⅱ液(Ⅴ膠原酶150U/ml，BSA1mg/ml)，現(xiàn)配現(xiàn)用。人心房肌細(xì)胞SK2通道電流的記錄:將急性酶分離的人心房肌細(xì)胞置于全細(xì)胞浴液中，選擇貼壁良好、折光性強(qiáng)、表面光滑的單個心房肌細(xì)胞作為研究對象，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式進(jìn)行SK2通道的電流記錄。所得電流通過膜片鉗放大器(EPC 10)放大，濾波(2kHz)后輸入計算機(jī)，經(jīng)Patc

6、hMaster采集軟件采集數(shù)據(jù)，Clampfit 10.1、OriginPro 8.0軟件進(jìn)行分析作圖。以人心房肌細(xì)胞為研究對象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:
　　(1)人心房肌細(xì)胞SK2通道電流基本特性研究。
　　(2)在全細(xì)胞膜片鉗模式下對比SR組和AF組SK2通道電流密度及其在混合電流中所占比例的差異。
　　(3)在全細(xì)胞膜片鉗模式下觀察PKA特異性抑制劑H-89對SK2通道電流的調(diào)節(jié)作用。
　　（二）蛋白質(zhì)水平測定

7、實(shí)驗(yàn)SR組和AF組心房肌組織標(biāo)本分別11例和13例，采用BCA法及ELISA法檢測SR組和AF組心房肌組織總蛋白及PKA水平。
　　結(jié)果:
　　(1)人心房肌細(xì)胞SK2通道特性:
　　①在全細(xì)胞膜片鉗模式下，給予SK2通道電流記錄的刺激方案，可記錄到混合電流，在浴液中加入SK2通道的特異性阻斷劑apamin(10-7mol/L)，加藥前后的混合電流相減即可獲得SK2通道電流。
　?、谠谌?xì)胞膜片鉗模式下，10-7

8、mol/L的apamin能夠抑制部分內(nèi)向整流混合電流，將apamin洗脫后，能夠基本恢復(fù)被抑制的電流。分析后結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)記錄到的心房肌細(xì)胞SK2通道電流具有內(nèi)向整流特性，且能被apamin特異性阻斷。
　　(2)與SR組相比，AF組SK2通道電流的改變電極液中鈣離子濃度為5×10-7mol/L時，在全細(xì)胞膜片鉗模式下記錄的AF組SK2通道電流明顯大于SR組。在-130mV鉗制電壓下，SR組和AF組SK2通道電流密度分別為-2.

9、61±0.14pA/pF、-6.21±0.59pA/pF（nSR=15，nAF=6，P＜0.05）;SK2通道電流在混合電流中所占比例分別為20.011±1.44％、42.87±1.79％(nSR=15，nAF=6，p＜0.05)。
　　(3)H-89對SR組和AF組SK2通道電流的調(diào)控10μmol/LH-89能夠降低SR組和AF組SK2通道電流密度，且對AF組SK2通道電流密度抑制更明顯。在-130mV鉗制電壓下，H-89對SR

10、組和AF組SK2通道電流密度抑制比分別為39.27±4.08％、76.32±2.94％(nSR=6，nAF=5，p＜0.05);H-89使SR組和AF組SK2通道電流在混合電流中比例下降，抑制比分別為37.48±4.77％、56.40±3.66％(nSR=6，nAF=5，p＜0.05)。
　　(4)PKA含量變化SR組和AF組PKA含量分別為511.91±7.22pg/mL、444.09±7.88pg/mL（nSR=11，nAF=

11、13，p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　(1)人心房肌細(xì)胞SK2通道具有內(nèi)向整流特性，且能被apamin特異性阻斷。
　　(2)電極液內(nèi)游離鈣離子濃度為5×107mol/L時，AF組的SK2通道電流密度及其在混合電流中比例大于SR組，提示SK2通道電流改變，是AF發(fā)生和維持的基礎(chǔ)之一，參與了心房電重構(gòu)過程。
　　(3)PKA能夠通過一定途徑調(diào)節(jié)SK2功能，抑制PKA可使SK2通道電流密度下降，且對AF患者心房肌細(xì)